单纯疱疹病毒2型衣壳支架蛋白ICP35原核表达载体的构建及其表达特性分析

本研究旨在构建单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)衣壳支架蛋白ICP35的原核表达载体,并分析其在HSV-2增殖中的表达特性。以HSV-2基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSV-2 ICP35的编码基因UL26.5,并克隆至原核表达载体pET-32a(＋),转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,将纯化的重组ICP35免疫家兔后获得抗体,采用免疫荧光检测ICP35在HSV-2增殖中的表达特性。结果显示,HSV-2 UL26.5基因的PCR产物大小约为1 065 bp,原核表达重组蛋白的相对分子质量约为6.3×10⁴,免疫家兔的血清抗体可特异性识别HSV-2 ICP35。免疫荧光检测结果显示,HSV-2 ICP35可在感染后8 h出现于细胞核周围,12 h表达量进一步增加并向细胞核内聚集,16 h后在细胞核、细胞质内均可检测到聚集成斑点状的衣壳支架蛋白。结果表明,HSV-2 ICP35原核表达载体的成功构建及对其在HSV-2增殖中表达特性的分析,将为研究UL26.5基因的功能、蛋白相互作用、病毒与宿主的相互作用及筛选药物靶标等奠定基础。     

us3基因的缺失对单纯疱疹病毒1型毒力和抗凋亡功能的影响

利用CRISPR/Cas9系统使单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1) ul7、ul41、LAT 基因缺失构建M3减毒株(M3株),在M3株基础上通过缺失 us3 得到M4突变株(M4株)。本研究旨在分析野毒株(McKrae株)、M3株与M4株在毒力和抗细胞凋亡方面的差异。结果表明,McKrae组出现明显的临床症状,且100%死亡(P<0.001),而M3、M4组未出现临床症状。M4组小鼠组织中病毒载量明显低于McKrae组和M3组;病理学检测表明,McKrae组出现蛛网膜出血、胶质小结等现象,而M3、M4组未见病理损伤,M4组炎性因子表达与McKrae、M3组相比也显著下降(P<0.01);免疫后M4组较M3组出现高水平的中和抗体、γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)和白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)抗原特异性T细胞;McKrae株再次感染时,M4组小鼠组织中病毒载量明显低于对照组和M3组;在人急性T细胞淋巴瘤细胞中,M4株相比McKrae株和M3株可明显诱导细胞凋亡。     

体外研究脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应系统的作用及其免疫学意义

尽管针对脊髓灰质炎病毒已经有长达数百年的研究并成功研制出了预防性疫苗,但是对于该病毒如何启动机体天然免疫反应,进而激活获得性免疫反应这一过程的具体分子机理仍有诸多空白。本研究通过体外分析脊髓灰质炎病毒Sabin减毒株Ⅰ型的结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应信号分子的影响,了解脊髓灰质炎病毒在上皮细胞中启动免疫信号的具体分子机制。采用PCR方法扩增脊髓灰质炎病毒四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,经酶切纯化后与pcDNA3.1+真核表达载体连接,分别构建含目的基因的四种重组质粒。将重组质粒分别转染至人呼吸道上皮细胞16HBE中,48h后收集培养上清、细胞。提取细胞的总RNA,利用Q-PCR法分别检测四种结构蛋白表达所诱导的天然免疫信号分子的mRNA表达量。同时,上清、细胞裂解物分别与人T细胞共培养,检测其对T细胞增殖的影响。体外在16HBE细胞中分别表达SabinⅠ病毒VP1～VP4四种结构蛋白均可刺激如LTα3、NIK等NF-κB天然免疫信号通路相关分子的表达,并且表达这四种蛋白的细胞裂解物与T细胞共培养后均表现出刺激T细胞非特异性增殖的效应。但是,仅有VP1、VP2表达所诱导分泌相关因子的培养上清才表现出间接刺激T细胞增殖的能力。SabinⅠ毒株的四种结构蛋白可激活NF-κB信号通路,促进T细胞的非特异性增殖,从而激活适应性免疫应答。