用人MHC转基因小鼠模型鉴定高致病禽流感病毒核蛋白CTL表位

目的:筛选高致病禽流感病毒核蛋白(NP)中可用于高致病禽流感病毒感染检测或疫苗设计的CTL表位,为评价疫苗接种效果和开发新型疫苗奠定基础。方法:根据NCBI公布的NP的核苷酸序列设计特异性引物,以2006年深圳株高致病禽流感H5N1病人分离的病毒cDNA为模板扩增NP全长基因(1500 bp)并测序。通过生物信息学方法,预测NP氨基酸序列中潜在的HLA-A觹0201限制性表位。构建重组pJW4303-NP核酸疫苗并肌肉免疫HLA-A2/DP4转基因小鼠,利用ELISPOT法筛选特异性CTL表位。结果:克隆了2006年深圳株高致病禽流感NP基因,构建的重组pJW4303-NP核酸疫苗能在体外COS-7细胞中表达,免疫小鼠后能引起小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫。结论:生物信息学和转基因小鼠模型筛选相结合的方法,能用于高致病性禽流感核蛋白CTL表位的筛选。     

一种单个胚胎的DNA模板制备方法

建立了一种简单处理单个卵子和早期胚胎制备DNA模板的方法——KOH/DTT-Triton X裂解法,并与TE-蛋白酶K法比较了PCR扩增效率。结果,采用KOH/DTT-Triton X裂解法处理单个卵子或2-细胞胚、8-细胞胚、桑椹胚、囊胚后,作为DNA模板直接进行PCR扩增线粒体DNA片段,3对引物的PCR扩增总成功率为100%（70/70）,而TE-蛋白酶K法处理的单个卵子的PCR扩增总成功率为92.9%（65/70）,二者差异显著（P<0.05）。但两种方法所制备模板的PCR假阳性率均为0。实验设计的KOH/DTT-Triton X裂解法是一种有效的单个早期胚胎的DNA模板制备方法,经一次PCR扩增即能获得清晰的目的DNA条带,能够满足早期胚胎遗传物质检测的需要。     

可调控小鼠尿激酶原激活剂真核表达载体的构建及其在Huh7细胞中的表达

目的：建立基于Tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂（uPA）的诱导表达系统。方法：提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与pTet-on瞬时共转染Huh7细胞系,24h后用强力霉素诱导表达,诱导后36h分别收集细胞和培养上清（诱导组）,提取细胞总RNA并进行细胞uPA转录水平的检测;采用溶圈法对细胞分泌至培养上清中uPA的生物活性进行检测,同时以转染但未诱导Hun7（未诱导组）和正常培养Huh7（正常对照组）细胞及培养上清作为对照。结果：与未诱导组和正常对照组相比较,仅诱导组在转录水平上扩增出目的条带;溶圈法证实转染的细胞不仅表达uPA,而且表达的蛋白具有一定的生物活性。结论：构建了可调控的uPA真核诱导表达系统,为进一步制备可调控肝细胞表达uPA转基因小鼠及进一步揭示uPA肝损伤机理奠定了基础。     

表达miR-192的重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达分析

目的：构建表达miR-192的重组腺病毒,感染HepG2细胞建立miR-192高表达的细胞模型,以研究miR-192在肝细胞中的功能。方法：将miR-192前体基因插入腺病毒穿梭载体pAdTrack,构建miR-192穿梭载体pAdTrack-miR-192,经线性化和同源重组,构建重组腺病毒载体pAd-miR-192;线性化后,在QBI-293A细胞中进行病毒包装;用包装成功的重组腺病毒感染HepG2细胞,72h后收集细胞,提取总RNA,逆转录后进行定量PCR,检测miR-192和潜在靶分子视网膜母细胞瘤基因1（RBl）mRNA的变化。结果：获得670bp的miR-192前体基因,经过穿梭载体后重组构建表达miR-192的腺病毒载体pAd-miR-192;将pAd-miR-192转染QBI-293A细胞,第8d细胞病变及荧光的表达结果表明重组腺病毒成功包装;感染HepG2细胞后,定量PCR检测表明miR-192的表达较对照增加了835．87倍,同时检测到细胞中RBlmRNA的表达显著降低。结论：构建了高效表达miR-192的腺病毒,建立了miR-192高表达的肝细胞模型,证明在肝细胞中抑制的RBl是miR-192靶分子,为后续miR-192在肝细胞中功能的研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S受体结合区蛋白片段在杆状病毒载体中的表达及其抗原性研究

目的:利用Bac-to-Bac1杆状病毒系统,在sf9昆虫细胞中表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)的S受体结合区蛋白片段,并对其免疫原性进行研究。方法:将S蛋白的受体结合区基因片段定向克隆至转座载体pFast-Bac1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,用抗生素平板筛选重组杆粒。脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞,待细胞形态明显改变后收获细胞和培养上清液。利用SARS病人恢复期抗血清做ELISA和Western印迹,分析重组蛋白的抗原性。结果:ELISA和Western印迹表明,在sf9昆虫细胞中表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白可与SARS病人恢复期抗血清发生特异反应。结论:获得了在昆虫细胞内表达的SARS-CoVS受体结合区重组蛋白,并证明该蛋白有可能用于SARS感染的抗体检测,为SARS-CoV免疫机制及其疫苗的进一步研究奠定了基础。     

用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用

目的:构建用于鉴定microRNA靶基因的报告基因系统。方法:在pGL3-Basic载体的luc基因上游插入CMV启动子,下游插入用于克隆靶基因3’UTR的多克隆位点,构建报告基因载体pMIR-luciferase;将pMIR-lu-ciferase载体的luc基因替换成Rluc基因,构建内参载体pMIR-control;将补体因子H(CFH)的3’UTR插入pMIR-luciferase载体的多克隆位点处,构建含有CFH 3’UTR的报告基因载体;用pIRES2-EGFP载体构建microRNA146a真核表达载体;将含有CFH 3’UTR的报告基因载体、microRNA146a真核表达载体及内参载体共转染HepG2细胞,进行报告基因的活性检测。结果:构建了报告基因载体、内参载体和microRNA146a真核表达载体,经酶切和测序鉴定正确;microRNA146a真核表达载体转染细胞72 h后,经荧光显微镜观察确认载体转染及表达;用实时定量PCR检测,microRNA146a的表达水平显著上调(P<0.01);用构建的报告基因系统检测,结果表明microRNA146a显著地抑制了含CFH 3’UTR的报告基因的活性(P<0.05)。结论:构建了一种新型的报告基因载体系统,该系统可用于miRNA靶基因的鉴定。     

抗GPC3 C端抗体辅助杀伤肝癌细胞HepG2的活性检测及抗原表位鉴定

目的：检测制备的7株抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）蛋白C端单克隆抗体是否具有辅助杀伤肝癌细胞的活性,并研究其识别的抗原表位。方法：用细胞增殖法检测制备的抗体是否具有抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性;用生物信息软件分析GPC3蛋白C端（359～580残基）的结构及抗原特征,并据此将其分为4个截短片段,将克隆的各基因片段分别连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,进行蛋白表达和纯化,用间接ELISA和Western印迹分析GPC3C端单克隆抗体的表位识别情况。结果与结论：制备的7株单克隆抗体对肝癌细胞HepG2均具有不同程度的辅助杀伤作用,其中5号单克隆抗体的辅助杀伤效果最好;表达并纯化了GPC3C端4个截短片段的重组蛋白;间接ELISA和Western印迹检测结果表明,7株抗体均特异性结合GPC3蛋白的473～525残基区段。     

卵胞质移植的研究进展

许多研究表明,线粒体对卵母细胞的受精和胚胎发育有显著影响,卵胞质中线粒体DNA含量和ATP含量的减少,以及线粒体DNA缺失均能降低卵母细胞的受精和胚胎发育,是老龄妇女和老龄动物生育率下降的重要原因之一。卵胞质移植技术能有效改善老龄卵母细胞的受精能力和早期胚胎的发育能力,在人类已有健康后代出生,它已成为人类辅助生殖生物技术和动物克隆研究的新热点。但是,卵胞质转移也可能会导致线粒体DNA异质,即供体和受体的线粒体DNA同时存在于后代体内。目前,人们对于转入的异质卵胞质中对胚胎的发生和发育造成影响的因素并不完全了解。通过卵胞质移植研究概况、卵胞质与受精和胚胎发育、异种线粒体DNA遗传方式和卵胞质转移遗传物质的检测4个方面对卵胞质移植技术进行讨论。     

分形理论在集材道土壤团聚体研究中的应用

分形作为一种几何工具,在处理非线性现象时十分有效。它从一个崭新的角度提供了探索局部结构与整体之间的联系方法,从而揭示了现象背后的局部与整体的本质特性和运动规律。目前,分形理论已广泛地应用于数学、物理、化学、材料科学、表面科学、生物与医学、地质和地理、地震和天文科学及计算机科学等领域的无特征尺度却有自相似性的体系中,以一种更有效、更通用的方式描述众多自然现象复杂的空间变异结构特征。同时,还能提供定量描述从小尺度到大尺度情形下的空间变异,因而成为研究和处理复杂现象强有力的理论工具。     

树杆注药防治油松扁叶蜂

用40%氧化乐果乳油对油松扁叶蜂Acantholyda posticalis posticalisMatsumura进行树杆注射用药,防治技术简单易行、省工省时、环境污染小、成本低、防效达97%,适用大田防治。