冠状病毒反向遗传技术的研究进展和应用

冠状病毒（Coronavirus,CoV）在分类上属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属,其基因组长度约为25 000 nt～30 000 nt。反向遗传技术可以针对RNA病毒的基因组进行突变,是研究病毒蛋白功能的有力工具,也是对毒力基因进行突变,构建减毒疫苗株的新型方法。冠状病毒反向遗传技术的建立和应用,推动了基因功能的研究和重组病毒疫苗的研发。本综述将介绍三种常见的冠状病毒反向遗传克隆技术,分别是基于痘病毒载体、基于细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）载体和基于体外连接的反向遗传技术。传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是成功建立反向遗传系统的冠状病毒之一,本文对反向遗传技术在IBV中的研究和应用进行了介绍和讨论。     

红火蚁巢穴土壤中生物碱成分分析

【目的】红火蚁Solenopsis invicta栖息在真菌和细菌较丰富的土壤环境中,容易受多种真菌和细菌性病原体的侵染,因红火蚁的毒液具有很好的防御和抗菌作用,致使红火蚁能生存于此类土壤环境中。为了探索这一奥秘,本研究旨在建立红火蚁巢穴土壤中的毒液生物碱的最佳提取方法,并对毒液生物碱成分进行定量分析。【方法】采集蚁巢周边3 m处的土壤,进行添加、回收红火蚁毒液实验。采用抽滤法提取土壤中的毒液生物碱,利用GC-FID对毒液生物碱成分进行定量分析,筛选最佳的提取溶剂,并且确定添加三乙胺的最佳体积比。然后用最优方法提取蚁巢土壤中的毒液生物碱,并进行定量分析。【结果】正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5种提取溶剂中,正己烷处理的生物碱回收率略优。当添加的三乙胺的体积为1 mL及以上时,提取效果最佳。红火蚁巢穴土壤中的毒液生物碱成分中,trans-C15∶1的含量最高,trans-C13∶1的含量次之。巢穴土壤中总生物碱含量约为22μg/g。【结论】三乙胺有助于提取蚂蚁巢穴土壤中的毒液生物碱。红火蚁巢穴土壤中的生物碱浓度较高,有可能对巢穴土壤微生物群落产生重要影响。     

细胞源与鸡胚源传染性支气管炎病毒激活JAK-STAT信号通路的差异性研究

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)对鸡的呼吸道、肾脏和输卵管等器官造成严重损伤,主要引起鸡产蛋率下降和雏鸡死亡.目前通过鸡胚传代获得IBV疫苗株和流行毒株.IBV Beaudette株是目前实验室研究的经典毒株,已经适应人源和猴源细胞,可利用Vero细胞进行制备.有研究表明,IBV感染延迟干扰素的表达,并对JAK-STAT信号通路具有拮抗作用.本研究中发现,通过Vero细胞制备的IBV Beaudette株,在感染早期激活STAT1,通过鸡胚制备的IBV Beaudette,则不能有效激活STAT1.进一步研究发现,鸡胚传代的IBV QX株和新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)亦不能有效刺激JAK-STAT信号通路.两种制备病毒的方式分别得到不同的试验结果,推测是由于在病毒感染条件下,Vero细胞分泌到培养液中的细胞因子所致.进一步研究揭示,病毒感染条件下,细胞分泌的因子,瞬时激活了 STAT1.本研究对于病毒的制备方式对天然免疫信号通路的影响,具有一定的参考和借鉴作用.     

通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)属于γ属冠状病毒,其核酸内切酶nsp15(Non-structural protein 15)的功能尚未得到解析.为探讨nsp15在IBV感染和复制过程中的作用,本研究对nsp15的核酸内切酶活性中心H238进行突变,通过体外连接技术构建重组病毒rIBV-nsp15-H238A,并对病毒滴度、感染复制能力和生长曲线进行鉴定.方法 如下:将IBV Beaudette-R毒株的基因组分成5个片段克隆到质粒载体,并在每个片段加上BsaI或BsmBI限制性酶切位点.通过质粒载体进行扩增后,通过酶切获得cDNA片段,在体外连接成全长基因组cDNA,转录出全长基因组RNA,跟N的转录本一起电击转染到Vero细胞,拯救出重组病毒rIBV和rIBV-nsp15-H238A.利用空斑试验检测比较rIBV和rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度和空斑大小,鉴定nsp15核酸内切酶活性对IBV感染性的影响.结果 显示,rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度为2.7×106PFU/mL,比rIBV的病毒滴度(9.4×106PFU/mL)低3倍还多,且rIBV-nsp15-H238A空斑孔径远小于rIBV,说明rIBV-nsp15-H238A复制和扩散能力远低于rIBV.利用TCID50检测病毒的生长曲线,结果表明在感染后0～24h,rIBV-nsp15-H238A的生长曲线均低于rIBV.由此可见,IBV nsp15H238核酸内切酶活性位点对IBV的感染复制起着重要作用.本研究通过反向遗传操作构建nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒,为研究nsp15的功能提供了一个有力的工具.     

盐酸胍对口蹄疫病毒完整颗粒和空衣壳的影响

在口蹄疫病毒的复制过程中，会形成完整的病毒粒子（146S）和一定量的空衣壳（75S）。本试验研究了盐酸胍在不同时间和浓度下对口蹄疫病毒146S和75S的影响，并筛选出75S产量最高的条件。通过蔗糖密度梯度离心、透射电镜、特异性单域抗体包被的双抗夹心ELISA等方法对75S和146S进行定性和定量检测。结果表明在口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染BHK-21细胞2 h时，加入4 mmol/mL的盐酸胍，75S产量比同时间下加入盐酸胍浓度为2 mmol/mL和8 mmol/mL时得到的75S含量高两倍，约为146S的三倍。本研究为定量口蹄疫病毒75S形态的免疫学方法建立奠定了前期研究基础。