Expression and regulation of hFIX minigene and cDNA driven by β-casein gene in mouse mammary gland

Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ,ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｕｓｉｎｇｍａｍｍａｒｙｇｌａｎｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｓｏｆｈｕｍａｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｄｒａｗｍｏｒｅａｎｄｍｏｒｅａｔｔｅｎｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ.Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｉｌｋｏｆｆｅｒｓｓｅｖｅｒａｌｐｏｔｅｎｔｉａｌａｄｖａｎｔａｇｅｓ:ｐｒｏｔｅｉｎｓｓｅｃｒｅｔｅｄｉｎｍｉｌｋ,ｗ…     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因…

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ｔｉ质粒转化材料,利用共培养法将苏云杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现：８００μｍｏｌ／Ｌ的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可转将化效率提高５０倍。     

建立外源基因乳腺组织特异性表达快速检测系统的探索

乳腺生物反应器研制是近年来生物工程领域的研究热点,有效的乳腺组织特异性表达载体的构建则是该工作的关键。为了验证外源基因乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效性,我们实验室探索利用重组逆病毒（retrovirus）、重组腺病毒（adenovirus）和SA脂质体（SAliposome）为介导,将外源基因及其表达构件导入活体奶山羊的乳腺组织,建外源基因乳腺组织表达的快速检测系统;取得了较为理想的效果。     

苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞及转基因植株再生的研究

以葡萄的胚性愈伤组织作为农杆菌介导,Ti质粒转化材料,利用共培养法将苏云金杆菌内毒素蛋白基因转入葡萄胚性愈伤组织细胞,通过胚状体发生途径再生转基因植株。实验发现:80μmol/L的乙酰丁香酮诱导处理农杆菌和葡萄愈伤组织后可将转化效率提高50倍。OD值为0.8的农杆菌菌液稀释8—10信后与在G培养基预培养10天的胚性愈伤组织共培养2—3夭,Ti质粒对葡萄愈伤组织细胞的转化效率可达50%左右。筛选得到的转基因植株在含Km 30 mg/L的选择培养基上继代存活6个月,生长正常;提取叶片染色体DNA做Southern blot,杂交结果为阳性。将转基因植株各部分切段置于含Km 50 mg/L的选择培养基上,能够脱分化产生抗性愈伤组织并能增殖。     

人凝血IX因子基因乳腺组织特异性表达载体的构建及其在奶山羊乳腺中的分泌性表达

血友病B(Hernophilia B)是由于人凝血IX因子(hFIX)缺乏所致的一种严重出血性疾病。常规治疗方法是通过输血或输入人浓缩凝血IX园子来实现的,因此患者很容易被肝炎病毒甚至爱滋病毒感染。近年来,人们期望通过转基因动物乳腺表达并从乳汁中分离生产hFIX蛋白,以解除血友病患者的痛苦。以转基因动物的乳腺组织即乳腺生物反应器生产外源蛋白具有原核生物,酵母以及离俸真核细胞生产系统所不具备的优点：生产的外源蛋白经过体内加工和修饰,特别是真核蛋白的转译后加工(如糖基化和羧基化)．其生化特性、生物学活性与天然蛋白完全相同^[1];另外从乳汁中生产外源蛋白不需要复杂的工厂设备。因此开展人凝血IX因子乳腺生物反应器的研究具有重要的经济意义和临床应用价值。转基因动物乳腺生物反应器的关键在于外源基因乳腺组织特异性表达载体的构建。我们利用小鼠MAR元件(Matrix attachment regions)．牛的β-casein基因调控顺序,hFIX mini-gene和hFIX cDNA分别建成两种乳腺组织特异性表达载体pMCIXm和pMCIX,经SA脂质体包埋载体DNA后直接转染奶山 羊乳腺小叶,hFIX蛋白在奶山革乳汁中获得瞬间分泌性表达,最高表达量为13.7ng/ml乳汁。其中含hFIX mini-gene的表达载体在奶山羊乳汁中的表达量高于含hFIX cDNA的表达载体．表明hFIX的in-tronl能够提高该基因在活体奶山羊乳腺中的表达。A7单抗和柠檬酸钡吸附检测表明乳汁中的hFIX 蛋白羧基化和活性比率都在90％以上。以上结果肯定了载体构建的正确性．不但为研制hFIX蛋白乳腺生物反应器提供了有效的表达载体,同时也表明利用阳离子SA脂质体包埋质粒DNA直接转染活体物乳腺可以作为验证乳腺表达载体构建正确性的快速检测手段。     

牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控

构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平 3倍以上     

椎动脉夹层致脑梗死4例病例报道并文献复习*

目的:分析椎动脉夹层(VAD)的临床特点,探讨其与脑梗死的关系。方法:回顾性分析4例VAD致脑梗死患者的临床资料,并结合文献复习。结果:本组4例VAD患者中,2例患者有高血压病史,1例有高血压病相关家族史,1例无相关病史或家族史;3例患者有10年以上的吸烟史;4例患者均表现为头晕、恶心呕吐、行走不稳等后循环缺血症状,其中2例有显著的头枕部痛;4例患者均经DSA确诊为VAD。3例患者行抗血小板药物治疗,1例行血管内介入治疗。3例患者康复出院;1例治疗后仍有显著的头枕部痛症状,拒绝进一步治疗予出院。结论:脑梗死患者有高血压病及长期吸烟史,表现为头晕、头枕痛等后循环缺血症状,应考虑VAD的可能。DSA是目前诊断VAD的金标准,及时规范的治疗可改善VAD患者的预后。     

激光辐照葡萄愈伤组织的过氧化物酶同工酶分析

利用法国产ＤＡＴＡＣＨＲＯＭ—５０００型染料脉冲激光器处理葡萄“胜利”品种的愈伤组织,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＰＡＧＥ）分离过氧化物酶同工酶,研究了激光辐照对葡萄生长发育和过氧化物酶同工酶表达的影响,发现：适当剂量的激光辐照能使葡萄愈伤组织明显提前分化;激光能够影响葡萄过氧化物酶同工酶基因的调控,适当剂量的激光能够促进该基因的表达;激光处理的愈伤组织在不同的生长发育时期与对照相比,过氧化物酶同工酶在数目和活性上有明显增加。