MicroRNA靶向病毒携带的microRNA模拟靶序列对病毒的抑制作用

Micro RNA模拟靶序列(target mimic,TM)通过竞争性结合miRNA,从而干扰miRNA对靶标m RNA的调控.我们前期工作发现:以黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)作为载体在植物体内表达TM序列有效地抑制了miRNA的活性或稳定性,从而消减了miRNA对靶基因的调控.但是,miRNA与CMV携带的TM序列的结合在一定程度上抑制了病毒的积累.研究分析了miRNA靶向病毒携带的TM序列对病毒抑制作用的内在原因.a.通过RNA印迹分析CMV携带不同miRNA TM序列对病毒积累的影响,进一步明确miRNA靶向病毒携带的TM序列对病毒的抑制作用;b.利用GFP作为报告基因,通过荧光显微镜、蛋白质印迹以及RNA印迹分析TM序列对重组病毒积累的影响;c.以GFP作为报告基因,利用荧光显微镜观察和免疫印迹方法分析模拟靶序列对GFP翻译的影响;d.利用CMV病毒的反式复制系统分析miRNA模拟靶序列对病毒负链RNA合成的影响.结果表明,多种植物内源的miRNA靶向CMV基因组携带的miRNA TM序列,在不同程度上抑制了病毒的积累,miRNA与其TM序列的结合抑制GFP蛋白的翻译和负链的合成.植物内源的miRNA通过与病毒基因组携带的miRNA模拟靶序列结合,通过抑制病毒蛋白的翻译以及病毒负链RNA的合成,从而降低了病毒的积累水平.基于该论文的研究结果有可能建立一种抗病毒的新方法.     

黄瓜花叶病毒CB7株系引起心叶烟坏死反应与RNA2相关

采用RT-PCR获得黄瓜花叶病毒CMV-CB7株系全长基因组cDNA,经克隆测序发现该CMV的RNA1、2和3分别为3356nt、3045nt和2218nt(序列登录号为:EF216866、DQ785470和EF216867).CMV-CB7基因组cDNA克隆体外转录RNA接种心叶烟引起坏死症状,而CMV-Fny则产生典型花叶.由CMV-CB7和CMV-Fny基因组RNA相互交换而构建6个假重组型病毒(C1C2F3、C1F2C3、F1C2C3、F1F2C3、F1C2F3和C1F2C3)活性分析表明:CMV-CB7基因组RNA2决定其在寄主上的症状反应.嵌合型RNA2(RNA2F5C3和RNA2C3F5)的寄主侵染活性测定表明:2b基因或RNA23′端非编码序列决定CMV-CB7在心叶烟坏死症状.RNA印迹分析结果显示:CMV-CB7和CMV-FnyF5C3引起寄主坏死与基因组RNA积累没有直接关系.     

基于烟草脆裂病毒构建同时表达2种外源蛋白的载体及其应用

目的 构建在整个寄主植物中能同时表达两个非融合蛋白的病毒载体。方法 以烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，缺失TRV RNA2的2b基因5"端279 bp并将其起始密码子ATG改变为AGG、同时引入豌豆早枯病毒（pea early-browning virus，PEBV）外壳蛋白（coat protein，cp）基因启动子，获得pTRV2e²载体；在pTRV2e²载体的2b和PEBV的cp启动子下游插入不同的外源基因，测定病毒TRVe²表达外源蛋白的能力、携带外源基因后重组病毒的稳定性以及分析蛋白质的生物学功能。结果 病毒TRVe²能快速同时表达2个非融合的外源蛋白，且至少能表达70 ku外源蛋白，且该病毒携带~2.0 kb外源基因能稳定存活于寄主植物中；病毒TRVe²可用于分析蛋白质的生物学功能以及2个蛋白质间的相互作用。结论 本文构建的重组病毒TRVe²为快速有效地表达2个外源蛋白以及分析2个蛋白质间的相互作用提供技术工具。