中老缅边境蚊虫标本中Nam Dinh病毒的分离和鉴定

2012年在云南省南部中老缅边境地区采集的库蚊中分离到3株病毒(YN12039、YN12040、YN12060),该病毒只引起C6/36细胞发生病变。负染电镜观察病毒颗粒呈球形,直径60~80nm,有囊膜,表面有刺突。采用RTPCR方法对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerase,RdRp)、HEL1(superfamily 1helicase)、S蛋白(spike protein)基因进行扩增,同源性分析显示3株云南新分离株与Nam Dinh病毒(NDiV)RdRp、HEL1、S蛋白氨基酸序列相似度最高,均为98%以上。系统进化分析结果表明,3株云南新分离株与NDiV的亲缘关系最近,处于同一进化分支。该研究结果丰富了NDiV病毒的信息,对NDiV病毒分子特征、分布区域和物种嗜性等特征提供了数据参考。     

淡泊明志，宁静致远--著名病毒学家，我国病毒生物技术的奠基人朱既明

朱既明（1917年9月～1998年1月）是中国科学院院士,国际著名病毒学家,也是我国生物制品研发和产业化的重要奠基人。他1917年出生于江苏宜兴,1939年毕业于上海医学院,1945留学英国,1948年获剑桥大学哲学博士学位。他在上海医学院公共卫生科实习时,深感当时的医学能治疗的疾病不多,而需预防的疾病不少,从此开始了为之奋斗半个世纪的预防医学事业。1939年毕业后,他随上海医学院迁往昆明,进中央防疫处工作并开始从事微生物学研究,成功研制了中国第1个自制抗生素--青霉素。     

人腺病毒41型(HAdV-41)在293TE细胞中的形态发生研究

为研究人腺病毒41型(Human adenovirus type 41,HAdV-41)的形态发生过程,将其接种于293TE细胞,收获细胞制作超薄切片并染色,通过透射电子显微镜进行观察。结果显示HAdV-41可以通过非网格蛋白陷窝、网格蛋白陷窝及直接穿入的方式进入细胞;细胞微绒毛可参与HAdV-41进入细胞的过程;进入细胞的HAdV-41包裹于囊泡内、溶酶体内或游离于细胞浆内;HAdV-41最终以游离状态靠近细胞核核孔,并释放核糖核蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)进入细胞核;子代HAdV-41最先出现在细胞核内;在HAdV-41复制过程中出现纤维丝状包涵体、致密包涵体及条索状致密包涵体,包涵体结构与HAdV-41的形态发生过程有关;最终,HAdV-41以裂解细胞方式释放。本研究揭示了HAdV-41形态发生的部分过程,进一步丰富了HAdV-41的生物学信息。     

原核表达人41型腺病毒(Ad41) 蛋白 V及其抗血清的制备

摘要：目的 人肠腺病毒Ad41被称为难养腺病毒,其难以培养的特性可能与次要核心蛋白V（Ad41 protein V,pV）表达不充分有关。本研究拟表达纯化Ad41 pV抗原,免疫动物制备抗血清,为研究Ad41难养性机理打下基础。方法 以野生型Ad41基因组DNA为模板,PCR扩增pV,克隆到原核表达载体pET30a(+),测序后,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达,固化金属亲和层析(IMAC)方法纯化,免疫BALB/c小鼠制备抗血清,将获得的抗血清用于Western blot检测Ad41感染各细胞系后pV的表达。结果 克隆得到包括完全编码区的pV基因,表达质粒转化BL21(DE3)菌株,使用1 m mol/L IPTG 37℃诱导4 h,pV以包涵体形式表达,或使用0.5 m mol/L IPTG 25℃诱导8 h获得可溶性表达。利用皮下多点注射包涵体的方法免疫小鼠,得到抗pV抗血清;使用纯化的可溶性pV作为抗原对抗血清进行了鉴定,表明该抗血清可用于Western blot检测。等量野生型Ad41感染293或293E12细胞（一株稳定表达Ad41 E1B55K基因的293细胞）后,pV在293E12细胞的表达明显高于293细胞。结论 成功克隆了Ad41 pV基因,表达纯化了重组蛋白,获得了可用于Western blot检测的抗血清,为进一步研究Ad41难养性机理打下了基础。     

发热伴血小板减少综合征病毒感染人源巨噬细胞形成包涵体结构

发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)是在我国首次发现的布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新型病毒,是新发传染病发热伴血小板减少综合征的致病病原。本研究通过免疫荧光共聚焦实验观察不同感染剂量和不同感染时相SFTSV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)在THP-1细胞内的动态定位特点,并应用电镜方法在超微结构水平观察不同感染时相THP-1细胞的胞内形态结构特征,发现SFTSV感染THP-1在胞内形成包涵体结构。研究进一步显示感染后的第3天核衣壳蛋白NP所形成包涵体的形态大小与感染后第7天培养上清中的病毒载量之间存在相关。本研究揭示SFTSV感染人源巨噬细胞THP-1形成的包涵体结构可能是SFTSV利用宿主细胞形成的特殊胞内结构以利于大量合成和产生新的病毒颗粒。     

RNA干扰机制的研究进展

RNA干扰(RNAi)广泛存在于各种生物体中,是参与细胞防御与分化调控的重要机制之一。RNAi的作用由双链RNA启动,通过在转录、转录后和翻译等多个水平上对同源基因表达的特异阻断和抑制来实现,清晰地阐明其作用机制将为功能基因组学、发育生物学,以及抗肿瘤、抗病毒的新策略研究提供重要的理论依据。本文综述了近年来有关RNAi机制的研究进展。     

马尔堡病毒形态特征研究

马尔堡病毒(Marburg virus)和埃博拉病毒(Ebola virus)属于丝状病毒科(Filoviridae)成员。该科病毒可导致严重的丝状病毒出血热(Filovirus hemorrhagic fever,FHF),具有成为生物恐怖武器和生物战剂的潜能。为对马尔堡病毒的形态特征进行总结,以期为我国丝状病毒的电镜鉴定提供信息。本研究通过透射电子显微镜技术对马尔堡病毒形态进行观察,以明确其病毒形态特征。研究结果表明,负染后的马尔堡病毒呈现多形性(Pleomorphism),病毒颗粒呈直径均一、长度不等的棒状或丝状及眼镜蛇样、球形、分支状。我国至今尚无分离到丝状病毒的报道,对该病毒的监测、预警具有重要意义。透射电子显微镜技术是鉴定丝状病毒的重要方法之一,明确丝状病毒的形态特征有助于该类病毒的电镜鉴定。     

杆状病毒表达EV71病毒样颗粒的装配、制备纯化与鉴定

将EV71P1和3CD基因片段克隆入同一杆状病毒穿梭质粒Bacmid中,构建出重组杆状病毒表达质粒Bac-mid-P1-3CD;脂质体介导其转染Sf9昆虫细胞获得共表达P1和3CD的重组杆状病毒(AcMNPV-P1-3CD)。用IFA和Western-blot法对表达产物进行鉴定和分析。电镜结果显示P1经3CD切割装配成了大小约为27nm的类球形颗粒(即EV71VLPs)。进一步分析影响杆状病毒表达系统的因素以对表达条件进行优化,结果显示MOI值和时间均可影响目的蛋白的表达,其中时间是主要因素。选择优化后条件利用无血清培养基对贴壁Sf9细胞在多层细胞培养器中进行VLPs的大量表达,密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE结果可见三条大小约为39kD、34kD和26kD的VP1、VP0和VP3特异性条带。纯化后EV71VLPs颗粒结构完好,为下一步EV71蛋白结构的基础研究和基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

人细小病毒B19病毒样颗粒的制备

采用昆虫杆状病毒表达系统,制备人细小病毒B19病毒样颗粒(VLPs)。先通过PCR方法合成细小病毒B19衣壳蛋白基因VP2,将其克隆到pFastBac1质粒,然后转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac感受态细胞,获得重组杆状病毒表达质粒Bacmid-VP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBac-VP2。利用rBac-VP2感染Sf9细胞表达B19VP2蛋白,通过间接免疫荧光、Western blotting等方法鉴定目的蛋白表达。采用两次超速离心的方法对表达产物进行纯化,纯化产物在透射电镜下可见直径约22nm的VLPs。本研究成功制备了人细小病毒B19的VLPs,为B19感染血清学检测方法的建立提供了参考。