聚乙二醇二缩水甘油醚交联氨基载体LX-1000EA固定化脂肪酶 *

聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE)作为双功能环氧试剂,在实验中被用于交联氨基载体LX-1000EA共价固定化海洋脂肪酶,经过处理后的载体共价固定化脂肪酶具有良好的效果。实验经过单因素初筛和正交试验,得到最佳的交联及固定化条件为0.75%交联剂浓度、交联温度35℃、交联时间3h、载体量1.25g、pH9.0、固定化温度55℃、固定化时间1h。对LX-1000EA-PEGDGE固定化酶与游离酶、戊二醛(GA)交联LX-1000HA-GA的固定化酶进行酶学性质的比较,发现LX-1000EA- PEGDGE固定化酶较游离酶最适反应温度未改变,与LX-1000HA-GA相同的是最适反应pH都由7.0提高为8.0。在最适条件中所测LX-1000EA-PEGDGE酶活达到78.84U/g,固定化改变了游离酶的酸碱耐受性,热稳定性和操作稳定性较游离酶和LX-1000HA-GA固定化酶均有提高。LX-1000EA-PEGDGE的热稳定表现优异,在60℃孵育3h后保留90%酶活;使用5次后仍能残余50%酶活;保存30天酶活仍保留60%。首次使用新型双环氧交联剂PEGDGE交联有机氨基载体共价结合固定化脂肪酶,为更有效的固定化方法提供了技术支持,同时也发现交联剂对固定化酶的性质存在较大影响。     

添加剂对大孔吸附树脂固定化脂肪酶的影响

利用大孔吸附树脂DA-201为载体对海洋脂肪酶固定化,并探寻添加剂对固定化过程的影响。分别以NH_4Cl、甘露糖和甘氨酸为添加剂,采用单因素和正交实验相结合的方法优化条件。结果显示,以NH_4Cl为添加剂的最优条件:柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH 6. 0,固定化温度30℃,载体投放量0. 5g,NH_4Cl浓度25mmol/L,固定化时间3. 0h,酶活力达到115. 27U/g;比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高47. 42%。以甘露糖为添加剂最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7. 0,固定化温度35℃,载体投放量0. 5g,甘露糖浓度10mmol/L,固定化时间4. 5h;酶活力达到122. 75U/g,比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高6. 50%。以甘氨酸为添加剂的最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7. 0,固定化温度20℃,载体投放量0. 5g,甘氨酸浓度为25mmol/L,固定化时间7. 5h;酶活力达到141. 69U/g,比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高26. 12%。采用不同添加剂对大孔吸附树脂DA-201的吸附固定化过程有较大影响,可以极大地提高吸附效率;同时发现缓冲液类型、pH、温度、添加剂浓度和固定化时间等对DA-201树脂吸附脂肪酶有很大影响,对后续吸附固定化工业酶研究有较好的参考价值。     

苹果遗传转化的研究进展

苹果的遗传转化技术通过分子手段改良苹果,有助于缩短其育种周期.最近十年,在该领域的研究取得很大进展,涉及到一些重要的苹果基因型及有用的外源基因.迄今,苹果的遗传转化主要采用农杆菌介导法,侵染与转化材料的再生是影响其转化效率的关键过程,了解其影响因素,寻找有利因素以提高转化效率是目前苹果遗传转化研究的重点。 Abstract:Techniques of apple genetic transformation can improve apple trees and shorten the breeding cycle by molecular methods.In the last years,great progress has been made in this field,which involves a number of important apple genotypes developed.So far,apple genetic ransformation mainly adopts Agrobacterium-mediated technique,involving infection and transgenic tissue regeneration,which are important steps to affect the transformation efficiency.The initial work to the date is to know and to search for the factors which can increase the efficiency.     

带内含子卡那霉素抗性基因双元载体构建及烟草转化

农杆菌介导法是植物基因转化的常用方法,然而由于筛选培养基中常用的抗生素头孢霉素和羧苄青霉素具有类植物激素活性,影响外植体的再生和转化频率。将一个植物的内含子插入卡那霉素抗性基因编码区的N端,合成了一个带内含子的卡那霉素抗性基因。构建带该基因的植物双元表达栽体pYP1202并转化烟草,受侵外植体在含卡那霉素50～200mg/L的选择培养基中抗性芽分化频率不受卡那霉素浓度影响,然而具有GUS活性的转化子占分化芽的比例却随着卡那霉素浓度的增加而升高。当培养基中加入500mg/L羧苄青霉素后受侵外植体产生的抗性芽频率比单一的卡那霉素筛选提高近1倍,高达91.4％,然而具GUS活性的转化子占抗性芽的比例仅有26.7％,在200m/L的卡那霉素筛选下,比例升至93.3％。用带内含子卡那霉素抗性基因构建的植物表达载体转化植物可以减少假抗性芽的产生。     

南海深海微生物酯酶EST12-7在制备(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用研究

利用来源南海深海的微生物酯酶EST12-7不对称水解反应拆分制备（R）-2-氯丙酸乙酯。并探寻了温度、pH、底物浓度、有机溶剂和反应时间等因素对酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的影响。结果表明,深海微生物酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的最佳反应条件为：13.8 μg/ml酯酶EST12-7,50 mmol/L（±）-2-氯丙酸乙酯,2%正癸醇,pH8.5,30℃,0.05mol/L Tris-HCl,反应60 min。在最佳反应条件下,（±）-2-氯丙酸乙酯的转化率可达49%,所制备的（R）-2-氯丙酸乙酯的光学纯度为98%。通过对酯酶EST12-7拆分制备（R）-2-氯丙酸甲酯和（R）-2-氯丙酸乙酯进行比较,2-氯丙酸酯中的链长对酯酶EST12-7拆分反应有极大的影响。     

红树林微生物DH-2胞外蛋白酶的性质及产酶条件优化

从大亚湾红树林土壤样品中分离得到产蛋白酶菌株,鉴定所产胞外蛋白酶的酶学性质以及菌株的最佳发酵培养条件。采用平板透明圈法筛选菌株,福林酚显色法测定蛋白酶的酶活,通过单因素和正交试验确定其最佳发酵培养基以及发酵条件。从壤样品中分离得到一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌DH-2,该菌株分泌的蛋白酶最适反应pH和温度分别为8.0和65℃,50℃保温处理60 min后,剩余酶活仍保留80%以上。该蛋白酶对多种金属离子、有机溶剂及表面活性剂均有较好的耐受性。确定该菌株产蛋白酶的最适条件:1%(m/V,下同)可溶性淀粉,1%胰蛋白胨、1%NaCl,初始pH 5.5及7%的接种量,40℃培养36 h。在最适条件下测得其发酵液的酶活为236.30 U/mL,约为初筛时的酶活的8倍。该蛋白酶具有较为广阔的作用温度和pH范围,金属离子、有机溶剂及表面活性剂耐受性好,酶的性质比较稳定。     

乙二醇缩水甘油醚交联海藻酸钠-羧甲基纤维素钠固定化脂肪酶

以海藻酸钠、羧甲基纤维素钠(CMC)为载体,分别以乙二醇缩水甘油醚(EGDE)和戊二醛为交联剂,采用包埋交联法对脂肪酶进行固定化,结果显示EGDE的交联效果要优于戊二醛,添加EGDE的固定化酶酶活最好。得到制备固定化酶的最优方案为海藻酸钠2.5%,CMC浓度1.5%,给酶量800U/ml复配载体,氯化钙5%,以0.02%的EGDE交联固定30min,由此制备得到酶活约为380 U/g的固定化酶,酶活收率约为50.09%。固定化酶的最适反应p H为8.5,比游离酶增大0.5个单位;最适反应温度是45℃,比游离酶提高5℃;耐热性能变好,且重复使用7次后仍能保持60%左右的相对酶酶活。     

新颖深海微生物酯酶EstC11的酶学性质及其在手性拆分乙酸苏合香酯中的应用

【背景】手性乙酸苏合香酯是重要的手性香料产品,在食品及精细化工等领域都有重要的应用。酶催化不对称合成手性乙酸苏合香酯产品具有极好的工业应用前景。【目的】研究酯酶EstC11的基本酶学性质及其在制备手性乙酸苏合香酯中的应用。【方法】对来自西太平洋深海热液口芽孢杆菌Bacillus sp.CX01中的新颖微生物酯酶基因EstC11进行克隆、表达及酶学性质鉴定。通过对p H、温度、有机溶剂等反应条件的优化提高酯酶手性拆分乙酸苏合香酯的光学纯度。【结果】酯酶EstC11的最适反应p H为8.5,最适温度为25°C,一些金属离子和有机溶剂对酯酶EstC11的水解活性具有不同程度的抑制作用。通过对反应条件的优化,在最适反应条件下(p H 9.0 50 mmol/L Tris-HCl,20°C,50 mmol/L底物浓度)反应3 h后,(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度达98%,得率为39%。【结论】通过对酯酶拆分条件的优化,手性拆分乙酸苏合香酯生成(R)-乙酸苏合香酯的光学纯度明显提高,为酯酶EstC11在工业化上的应用奠定了基础。     

南海深海新颖低温脂肪酶的克隆、表达及酶学性质鉴定

从南海深海放线菌Pseudonocardia antitumoralis SCSIO 01299中克隆一个脂肪酶基因 lipaseB5。lipaseB5 基因片段大小为972bp,编码的蛋白质具有323个氨基酸残基并与Pseudonocardia sp. HH130629-09中假定脂肪酶有98%的同源性。以pET28a(+)为载体,将重组质粒转化到E. coli BL21(DE3)中,实现lipaseB5高效表达,并利用Ni-NTA 亲和层析纯化lipaseB5。LipaseB5最适反应底物为对硝基苯酚癸酸酯(p-NPD),最适温度为30℃,最适反应pH为7.5。LipaseB5催化p-NPD水解反应的活性达到140.14U/mg,V_max和K_m分别为109.8μmol/min、0.976mmol/L,催化橄榄油的活力为32.019 7U/mg。LipaseB5在pH7.5~8.5保持良好的pH稳定性;在10~20℃低温下保持较高的酶活力,在10~40℃内具有温度稳定性。LipaseB5对大部分金属离子有很好的耐受性,低浓度的Li⁺、Mg²⁺对该酶活性有促进作用。LipaseB5对高浓度的NaCl有很好的耐受性,在100mmol/L的NaCl存在下,酶活性大约保持在103%。LipaseB5对多种短链醇类有机溶剂和表面活性剂有很好的耐受性,TritonX-100、Tween-80和Tween-20对lipaseB5酶有激活作用。     

苹果遗传转化的研究进展

苹果的遗传转化技术通过分子手段改良苹果,有助于缩短其育种周期。最近十年,在该领域的研究取得很大进展,涉及到一些重要的苹果基因型及有用的外源基因。迄今,苹果的遗传转化主要采用农杆菌介导法,侵染与转化材料的再生是影响其转化效率的关键过程,了解其影响因素,寻找有利因素以提高转化效率是目前苹果遗传转化研究的重点。