基于广泛靶向代谢组学的竹黄活性成分分析

竹黄是我国一种重要的药用真菌,在医学、农业、食品等方面应用广泛且前景可观。为深入挖掘竹黄中有药理活性的有效化学成分,了解其在生长发育过程中不同时期代谢物的变化规律,利用广泛靶向代谢组学技术检测了竹黄子座不同发育时期的代谢物,找出差异代谢物并进行代谢通路分析。从竹黄子座中共检测出612种代谢物,前期和中期特有27种代谢物。黄酮类、奎宁酸、香豆素等具有良好生物活性的化合物首次在竹黄中被检测到。筛选出的差异代谢物主要是脂质、氨基酸、核苷酸、黄酮类、萜类、有机酸等物质,其中黄酮和氨基酸类化合物占主要地位。通过对代谢通路富集分析,获得6条具有显著意义的代谢途径。黄酮类化合物被认为是除竹红菌素外与竹黄药效有重要联系的化合物。本研究为竹黄药用机理及有效成分深入研究提供了一定的理论基础,为竹黄有效成分的代谢途径解析提供参考。     

冠突散囊菌转录因子stf1基因的克隆及其表达分析

利用RACE技术获得了冠突散囊菌stf1基因的全长DNA序列。该序列全长3 029bp,开放阅读框长度为2 664bp,从114–2 908bp,在253bp处含有一个131bp的内含子,预测编码887个氨基酸。同源分析结果表明该基因与Snd1/p100转录因子同源。应用相对定量SYBR Green I荧光定量PCR技术对stf1基因在不同发育时期的表达量的差异进行了检测。结果表明,这个基因在子囊孢子时期的表达量最高,在分生孢子时期的表达量最低,相比子囊孢子时期下降了1倍。为深入研究冠突散囊菌的产孢调控机制奠定了一定的基础。     

冠突曲霉 veA基因缺失型与野生型的差异代谢物研究

为了鉴定冠突曲霉 veA基因缺失型与野生型的差异代谢物,寻找与 veA 基因产孢相关的代谢物,采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）的代谢组学技术,分别收集2个菌株培养48h的菌丝体,经液氮研磨、超声萃取、三甲基氯硅烷衍生化后上机检测,将GC-MS检测的数据进行前处理和代谢物注释,并用统计学相关软件进行差异物筛选和相关性分析。结果显示,共鉴定99种代谢物,其中差异代谢物41种,野生型菌株中表达上调的显著差异代谢物有20种, veA缺失型菌株中表达上调的显著差异代谢物有21种,并预测差异代谢物的相关性,发现与623种代谢物产生相关性,其中313种呈正相关,310种呈负相关。筛选出来的差异代谢物涉及有机酸、氨基酸、碳水化合物、醇类、脂肪酸类等多种代谢物质,其中有机酸和氨基酸类代谢物占主导地位。本研究结果为进一步研究冠突曲霉代谢物与产孢的关联提供了一定的理论基础。     

利用抑制性差减杂交技术鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因

谢瓦氏曲霉间型变种Aspergillus chevalieri var.intermedius俗称"金花菌",是茯砖茶发酵中的优势菌种,该菌在不同的渗透压胁迫下产生不同类型的孢子。采用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),以低渗条件下产生的子囊孢子和高渗条件下产生的分生孢子为材料分别与营养菌丝体构建两个正反向文库。每个库随机挑选400个阳性克隆进行测序。然后将所得到的基因片段在GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,筛选出的差异表达的基因涉及蛋白质代谢、细胞代谢、转录调控等多个方面,其中可能参与有性产孢调控的基因有13条,可能参与无性产孢调控的基因有10条。     

古尼拟青霉最佳镇痛活性培养基的筛选

以1株有镇痛活性的古尼拟青霉为试验材料,从5种培养基中筛选出使该株产生最佳镇痛活性成分的培养基。结果表明:产生镇痛活性成分的最佳发酵时间为6 d,最佳培养基为改良沙氏培养基Ⅰ,其成分为葡萄糖20 g,甘油5 g,可溶性淀粉5 g,KCl 0.5 g,MgSO4.7H2O 0.5 g,KH2PO4.3H2O 1 g,FeSO4.7H2O 0.5 g,pH 7～8。     

赤散囊菌MAPKs超家族的鉴定及分析

本研究以赤散囊菌Eurotium rubrum全基因组序列为对象,利用HMMER软件构建隐马尔可夫模型（hidden markov models,HMM）结合BLAST的方法鉴定了促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）超家族。通过构建系统发育树对鉴定蛋白进行分析,并利用MEME软件进行了保守性基序的预测及活性位点注释。分析结果表明,赤散囊菌基因组包含了4个MAPK蛋白,分别属于Hog1-type、MpkC-type、Slt2-type和Fus3/Kss1-type类型;3个MAPK kinase（MAPKK）蛋白,分别属于MKK1-type、Pbs2-type和Ste7-type类型;3个MAPK kinase kinase（MAPKKK）蛋白,分别属于BCK1-type、Ste11-type和Ssk22-type类型。保守性基序分析及注释结果表明,MAPKs超家族蛋白都包含了蛋白激酶活性位点“-D[L/I/V]K-”以及保守性的ATP-binding标签序列。MAPK与MAPKK蛋白分别包含了“-TxY-”和“-SD[I/V]WS-”磷酸化位点,且MAPK蛋白还包含一个保守性的common docking基序（CD motif）,而MAPKKK蛋白则包含了一个功能不明的保守性基序,其一致性序列为“-GTPYWMAPEV-”。研究结果为揭示MAPKs信号途径在赤散囊菌中参与调控的生物学过程奠定了基础。     

茯苓种质资源的RAPD分析

为探讨国内茯苓人工栽培的主要品种和贵州野生茯苓菌株亲缘关系,利用RAPD技术对供试菌株的基因组DNA进行了分析。从41个随机引物中筛选出17个有效引物,共检测到101个RAPD标记位点,其中39个位点(38.6%)具有多态性,通过PAUP软件进行数据处理,采用最大简约法(MP法)进行聚类分析,并建立系统树。结果表明:不同来源的茯苓菌株亲缘关系非常相近,仅在某些引物的扩增物上存在较小的差异。     

谢瓦氏曲霉间型变种(Aspergillus chevalieri var.intermedius)esdC基因全长cDNA克隆与序列分析

为探究esdC基因在谢瓦氏曲霉间型变种的结构特征,从已构建的抑制性差减文库(SSH)中筛选得到esdC基因的EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增该基因片段的5’和3’端,拼接得到全长cDNA1472bp。通过序列分析,该cDNA序列含有一个开放阅读框(ORF),长度为819bp,从396~1214bp,含有30个腺嘌呤尾巴。预测编码273个氨基酸,该蛋白质的等电点pI为9.51,分子量为30.26558kD,为不稳定蛋白。序列同源性分析表明:该基因与费希新萨托菌(Neosartorya fischeri NRRL181)有性发育蛋白EsdC相似度最高,为78%,其保守区序列主要集中于蛋白质的N端。本实验为进一步研究esdC基因的分子功能及可能参与的调控途径奠定基础。     

谢瓦氏曲霉间型变种YchF基因cDNA全长克隆及序列分析

从谢瓦氏曲霉间型变种抑制性差减杂交(SSH)文库中,筛选到一个子囊孢子时期差异表达的序列标签A0128.860,以其序列为模板设计特异性引物,利用RT-PCR及RACE技术克隆获得了该基因的全长cD-NA,命名为eYchF.生物信息学分析显示,该基因包含一个1182 bp的完整开放阅读框(ORF),编码393个氨基酸,相对分子质量为43.4669 kD,预测的理论等电点为6.99,包括一个保守的G domain (guanine nu-cleotide-binding domain)和一个TGS (ThrRS, GTPase, SpoT) domain,为疏水蛋白.序列同源性分析表明:该基因与棒曲霉(Aspergillus clavatus NRRL 1)的GTP结合蛋白YchF相似度为84%,谢瓦氏曲霉间型变种YchF基因的克隆及生物信息学分析为YchF的进一步研究奠定了基础.     

谢瓦氏曲霉间型变种esdC基因的功能分析

为了研究谢瓦氏曲霉间型变种esd C基因的功能,构建该基因的敲除载体,通过农杆菌介导转化及筛选获得敲除突变体,并对突变体的形态进行了初步分析。生物学特性显示:△esd C突变子的子囊结构与野生型相似,子囊孢子均为球形或近球形,无性发育也与野生型无显著差异。但是,在MYA培养基上培养14d后,△esd C突变体菌落的渗出液相对野生型较少,且无皱褶,菌落表面干燥。这些结果表明esd C基因的缺失对孢子结构的影响不显著,为谢瓦氏曲霉间型变种有性调控机制的研究奠定了技术基础。