非限制性内切核酸酶Sma的表达纯化工艺及性能研究

目的:大量表达非限制性内切核酸酶Sma并获得高纯度目的蛋白,对其酶活进行鉴定。方法:PCR获得Sma基因片段,构建pET28a-omp A-Sma表达载体,转入E.coli BL21(DE3)中,筛选出不同培养基下,目的蛋白可溶表达量最高的条件。通过渗透休克方法提取目的蛋白,并经离子交换纯化。检测不同的温度条件下Sma的酶活,并与商品化产品进行比较。结果:经PCR和测序证明重组蛋白表达质粒构建正确。可溶蛋白产量为7mg/L,每升培养基获得7 300k U的Sma,纯化后纯度95%,活性达273U/μl(商品化产品为250U/μl)。结论:成功地表达了可溶性非限制性内切核酸酶Sma,纯度高、活性好,各项条件下活性皆不低于商品化产品。     

绵羊胎儿成纤维细胞体外培养及转基因研究

目的用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养绵羊胎儿成纤维细胞,探讨绿色荧光蛋白对绵羊胎儿成纤维细胞生物学特性的影响.方法体外分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,经脂质体介导EGFP基因转染第一代成纤维细胞,G418筛选10～12*!d,挑选转基因单克隆细胞,传代培养,进行细胞形态观察、生长曲线以及染色体核型分析,并进行了培养细胞性别鉴定.结果整合有EGFP基因的绵羊胎儿成纤维细胞生物学行为与未转染外源基因的细胞无明显差别,根据荧光强度可直接反应外源基因的表达量.结论 EGFP基因作为体内报告基因可用于转基因细胞的研究,并将整合有EGFP基因的转基因细胞为克隆动物提供核供体奠定了基础.     

运用全因子试验方法优化单抗生物类似药生产过程中的糖基化分布

旨在调控单抗生物类似药的糖基化分布,使其与原研药一致。通过全因子设计试验考察不同浓度的半乳糖、尿苷、氯化锰和蛋白水解物对单抗糖基化修饰的影响。结果表明,半乳糖、尿苷及氯化锰均能提高单抗半乳糖基化,且对细胞生长和单抗产量无明显影响。此外尿苷和氯化锰还能降低五聚高甘露糖型(Man5),但过量的尿苷会导致Man5增高。而蛋白水解物除了能降低Man5,提高单抗岩藻糖基化外,对细胞生长也有促进作用。选取模型预测的最优条件进行反应器培养验证,最终的单抗糖基化分布符合预期,成功建立CHO细胞单抗糖基化调控的生产策略。     

微生物学“绪论”教学中培养学生独立思考和系统性学习能力

在微生物学教学中注重培养学生的独立思考和系统性学习能力是实施创新教育的重要途径。"绪论"作为微生物学课程的第一节课内容,要帮助学生培养独立思考能力,并对微生物以及微生物学这门课程的内容建立一个整体框架。"绪论"部分的重点是介绍微生物学发展史和微生物的五大共性。在微生物学发展史的教学过程中,以巴斯德的曲颈瓶实验为切入点,让学生掌握从不同层面去思考同一个问题。另外,通过介绍微生物学发展史后的分组讨论,让学生体会科学发展规律和独立思考的重要性。微生物的五大共性是微生物的"微小"特点所决定的,而且这五大共性之间存在严谨的逻辑关系。微生物的五大共性是微生物各个方面特点的核心,与周德庆编著的《微生物学教程》中各章节内容和顺序相吻合,能帮助学生建立大框架,易于把后继学习的一个个知识点放进这个框架,系统学好微生物学。     

基于“以学为中心”的微生物学课程设计的探索与实践

课程建设是解决当前教学问题的着力点,而课程设计是课程建设的重中之重,决定着一门课程能否达成教学目标。本次教学改革依据"以学为中心"的教学理念和"一致性建构"的原则,采用Dee Fink教授的"整合性课程设计"框架,重新设计微生物学课程的学习目标、学习活动和学习测评。尤其是"学习目标"中,不仅涵盖核心知识、学以致用和触类旁通,更强调人性维度、志趣情怀和学会学习。同时运用"对分课堂"教学模式组织教学。课程结束一年后,问卷调查结果显示,学生对达成各学习目标的认同度在64%-87%之间。这说明,"以学为中心"的课程设计一定程度上达到了预期效果,值得进一步探究。     

人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因的克隆及在HeLa细胞中表达的研究

目的：构建人脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad gene,fhit）基因与报告基因egfp的双顺反子表达载体及融合表达载体,研究fhit基因过表达对HeLa细胞生长及凋亡的影响。方法：根据已知fhit基因的mRNA序列,RT-PCR得到493bp的cDNA序列,将其构建到pMD18-T中,筛选目的片段插入正确的重组质粒,经限制性内切酶切割,回收目的片段分别插入双顺反子表达载体pIRES2-EGFP和融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中。再以脂质体介导转染HeLa细胞,G418筛选稳定转染的克隆,分别通过基因组PCR、RT-PCR、免疫细胞化学及TUNEL法在DNA、RNA和蛋白质水平检测其表达情况。结果：转基因细胞基因组PCR获得493bp片段,证明目的基因已整合到细胞基因组中;RT-PCR检测其在RNA水平得到表达;免疫细胞化学及TUNEL法分析表明fhit基因在HeLa细胞内实现了稳定遗传与表达。结论：实验证明fhit基因过表达可有效促进HeLa细胞的凋亡。     

马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因转化烟草研究

将马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因由重组质粒pAPI189中亚克隆到双元表达载体pGA643的XbaI和KpnI位点之间,构建成高效表达重组质粒pGAPI3。三亲融合法将其转移至农杆菌LB4404。通过叶盘法利用此融合后的含有目的基因的农杆菌转化烟草叶圆片,在含有Km的培养基上筛选抗性芽。将抗性芽接种到生根培养基至长成完整植株后再移栽到土质中以获得转基因植株。通过目的基因的特异引物进行PCR检测以及目的基因的片段为探针进行Southern杂交检测,证实已获得马铃薯天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因的转基因烟草植株。 Abstract：An aspartic proteinese inhibitor gene contained in the recombinant plasmid pAPI189 was inserted into the XbaI and KpnI site of binary vector pGA643 for constructing subclone pGAPI.The pGAPI was introduced into Agrobacterium LB4404 by coculturing the mixture of DH5α(pGAPI)、HB101(pRK2013) and Agrobacterium LB4404.We transformed tobacco leaves by coculturing them with Agrobacterium LB4404 which contained aspartic proteinese inhibitor gene and then screening the shoots with T?medium containing kamnamycin (Km,100μg/ml).The shoots resistant to Km were transferred into the rooting medium.When roots were formed the whole plants were transferred into pots.PCR reaction using the primers complementing with potato aspartic proteinese inhibitor gene and Southern hybridization using the the fragments contained aspartic proteinese inhibitor gene as the probe were performed.The results of PCR and Southern hybridization showed that we obtained the transgenic tobacco plants.     

“对分课堂”教学模式在微生物学教学中的应用

"对分课堂"是国内学者新近提出的一种教学模式,作者在生命科学专业基础课程"微生物学"的教学实践中,初步应用了这种模式,力求将传统课堂教学的优点与讨论式课堂的优点有机结合,在激发学生学习积极性和自主性的基础上,增加师生互动、生生互动,培养学生的批判性思维,促进其个性发展,通过拓展教学时空、增强教学吸引力,更好满足以质量提升为核心的内涵式发展要求。     

猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达及其对伪狂犬病病毒的抑制

目的:研究猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达并检测其是否对伪狂犬病病毒(PRV)具有抑制作用。方法:从IBRS-2细胞和MDBK细胞中分别调取猪Mx1和牛Mx1基因,并克隆到pc DNA3.1/myc-His(-)B,构建得到真核重组表达质粒,以脂质体转染的方法将其分别导入到PK-15细胞,从mRNA水平和蛋白质水平鉴定重组质粒在细胞内的表达情况,然后用细胞毒性试剂盒检测这两种蛋白是否对PK-15细胞具有毒性。之后,通过荧光定量PCR检测猪Mx1和牛Mx1在攻毒后不同时间、不同攻毒剂量的条件下对PRV的抑制情况,并观察100TCID50病毒攻击细胞72h后的病变程度。结果:成功克隆了猪Mx1和牛Mx1基因,经mRNA水平和蛋白质水平证实,两种重组质粒在PK-15细胞内能够正常表达。从荧光定量PCR和细胞病变的角度来看,细胞内表达的Mx1蛋白对PRV具有显著性的抑制(P0.001)。结论:猪Mx1和牛Mx1基因在PK-15细胞中表达的Mx1蛋白能够抑制PRV在胞内的复制。     

对分课堂在生物教学中的效果反馈分析

PAD(Presentation-Assimilation-Discussion)课堂即对分课堂,是一种突破传统课堂、但又区别于翻转课堂和研讨式教学的新模式,已被列入上海市教委新进教师培训内容和教育部网培中心"卓越教学法"系列,正在被广大教师采用。笔者2015年首次将对分课堂引入高等生物学教学,迄今已分别在专业必修课"微生物学"和通识选修课"改变生活的生物技术"中全程实践,共4个学期。本文分析了关于PAD教学模式的106份有效问卷,给读者呈示出该模式在生物学教学中的应用效果,希望为同行提高课堂教学质量提供一种思路,推荐一种新模式。