常规PCR与RACE结合法快速从cDNA文库中克隆基因

首先根据Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因家族的保守区设计同源的常规PCR引物(F1，R1)，扩增出490bp的特异片段。然后根据RACE法原理，巧妙地设计3′RACE(F2)和5′RACE(R3)特异性引物，使两者既能分别与文库载体上的筛选扩增引物配对扩增cDNA 3′和5′末端序列，又能使扩增出的3′RACE和5′RACE产物序列有重叠部分；另外设计引物时还兼顾到使F2和R3也能配对，从而能对3′RACE和5′RACE扩增产物进行双特异性引物常规PCR鉴定。该方案不但能够直接根据序列鉴定3′RACE和5′RACE产物是否为同一基因序列，还能快捷地用常规PCR鉴定3′RACE和5′RACE扩增产物是否为特异性扩增，避免了对非特异性扩增产物的克隆测序等繁琐的鉴定过程，优化了基因克隆策略。最后根据拼读出的全长序列设计引物(F4，R4)扩增出完整编码区。应用该方法成功地从小金海棠缺铁处理的根系cDNA文库中克隆了Fe(Ⅱ)-转运蛋白基因的cDNA。说明该方案是一种从cDNA文库中克隆目的基因的快捷优化方法。