EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞系中通过NF-κB、AP-1促进IL-8分泌

目的：探讨EB病毒LMP1分子致瘤机制，在已证实鼻咽癌细胞系中LMP1有效激活NF－κB 或AP－1的基础上，对LMP1是否通过NF－κB 或AP－1促进IL－8分泌进行探讨。方法：以稳定表达LMP1及其3种突变体，空白载体的鼻咽癌细胞系[HNE2-LMP1,NHE2-MLP1(1-185),HNE2-LMP1(1-231),HNE2-LMP1Δ187-351和HNF3－pSG5]及antisense-LMP1处理的HNF2－LMP1鼻咽癌的细胞系为材料，将IL－8报道质粒瞬时导入这些细胞系中，通过测定luciferase值以反映LMP1是否促进IL－8转录；将mut AP-1/IL-8-luc或IκB α（S32A／S36A）表达质粒导入HNE2－LMP1细胞系中，比较其IL－8报道活性，以确定LMP1是否通过AP－1或NF－κB 诱导IL－8转录；利用ELISA方法测定HNE2－LMP1，HNE2－pSG5,anti-sese-LMP1处理的HNE2－LMP1鼻咽癌细胞系中的IL－8浓度，进一步从蛋白水平上确定LMP1是否促进IL－8分泌。结果：与HNE2－pSG5相比，在HNE2－LMP1，HNE2－LMP1Δ187－351和HNE2－LMP1（1－231）细胞系中IL－8报道活性分别升高了原来水平的11．5，8．6和3．4倍，而HNE2－LMP1（1－185）对IL－8报道活性不影响。在HNE2－LMP1细胞系中IL－8蛋白水平提高了17．4倍，而antisense-LMP1则使HNE2－LMP1细胞的IL－8报道活性及蛋白水平分别下降到原来水平的18．3％和9．2％，导入mutAP-1/IL-8-luc或IκBα（S32A／S36A）的HNE2－LMP1细胞中IL－8报道活性分别下降到原有水平39％和26％，结论：鼻咽癌细胞系中LMP1可能通过NF－κAP－1促进IL－8表达。     

EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中通过IκBα的降解活化NF-κB

目的　阐明鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)活化核转录因子NF κB的机制。方法　利用强力霉素Dox诱导表达LMP1的鼻咽癌细胞株Tet on LMP1 HNE2为实验模型 ,首先应用免疫印迹方法测定Dox诱导后不同时相LMP1的表达动力学以及IκBs蛋白量及功能的改变。进而用间接免疫荧光法检测NF κB的亚细胞定位。最后采用瞬间共转染及报道基因活性分析分析NF κB的活性。结果　在鼻咽癌细胞Tet on LMP1 HNE2中 ,Dox处理 15分钟后LMP1的表达迅速升高并维持与较高水平直至 12 0分钟。LMP1的诱导性表达导致IκBα的磷酸化并降解 ,但IκBα蛋白总量无改变。继IκBα的磷酸化并降解 ,NF κB(P6 5 )自胞浆易位至胞核且活性升高。IκBα的显性负性突变子抑制NF κB(P6 5 )的核易位及报道活性。LMP1的诱导性表达并未引起IκBβ蛋白水平变化。结论　在鼻咽癌细胞Tet on LMP1 HNE2中 ,EB病毒LMP1通过IκBα的磷酸化并降解激活核转录因子NF κB的活性 ,并且 ,LMP1诱导的NF κB活性能被IκBα的显性负性突变子完全抑制。IκBβ在此信号传导途径中无改变。LMP1表达前后IκBα蛋白总量维持恒定可能是由于NF κB的活化迅速启动了IκBα的重头合成这一自身调节环路所致。     

LMP1通过Survivin抑制60Co诱导鼻咽癌细胞凋亡

目的　研究EB病毒编码的潜伏膜蛋白 1(LMP1)介导凋亡抑制蛋白 (Survivin)表达对辐射效应的影响。方法　利用LMP1可调控表达鼻咽癌细胞系 (Tet on LMP1HNE2 )诱导LMP1表达 ,同时 60 Co照射 5Gy ,采用形态学观察、流式细胞术和半胱氨酸蛋白酶 3(Caspase 3)活性检测等方法 ,分析LMP1表达对60 Co诱导鼻咽癌细胞凋亡的影响。用反义Survivin寡核苷酸阻断Survivin表达 ,观察Sur vivin表达阻断对60 Co辐射效应的影响。结果　LMP1表达抑制60 Co诱导鼻咽癌细胞凋亡 ,LMP1表达60 Co照射组形态学和流式细胞术检测凋亡率 (32 .7%± 2 .1% ,6 .3% )明显低于LMP1表达阴性组 (6 6 .0 %± 3.0 % ,2 9.6 % ) (P <0 .0 5 ) ;转染Survivin反义寡核酸后细胞凋亡率 (5 9.3%± 3.2 % ,3.0 % )明显高于对照组 (2 6 .0 %± 2 .6 % ,8.6 % ) (P <0 .0 5 ) ;同样转染Survivin反义寡核酸组Caspase 3活性 (3.78nmol/ 10 6)高于对照组 (2 .79nmol/ 10 6)。结论　提示LMP1通过介导Survivin表达而抑制60 Co照射诱导凋亡 ,Survivin反义核酸协同辐射诱导肿瘤细胞凋亡 ,Survivin作为增敏放射治疗靶 ,具有潜在的临床意义。     

p16基因的表达上调对鼻咽癌细胞恶性表型的影响--p16基因在鼻咽癌中的改变系列研究(Ⅱ)

目的:探讨上调p16基因的表达对鼻咽癌细胞恶性表型逆转的作用,为p16基因在鼻咽癌发病过程中具有一定的作用提供直接的证据.方法:本文采用电穿孔的方法向p16基因表达下调的鼻咽癌细胞系HNE1中导入全长野生型的p16cDNA,通过G418筛选获得可以稳定传代的转染细胞系.对其中4个转染细胞系以PCR和Northern杂交鉴定转染细胞系中外源p16cDNA整合以及p16基因表达的状况.并借助比较细胞倍增时间,流式细胞计数和裸鼠接种的方法对转染细胞的恶性表型进行了检测.结果:在所鉴定的4个转染细胞系中有一个转染细胞?#4-2)不仅整合了外源p16cDNA,且p16基因的表达明显增高.与未转染的鼻咽癌细胞系HNE1及未整合外源p16cDNA的转染细胞系相比,#4-2细胞的倍增时间延长,停滞于G1期的细胞数明显增多,接种裸鼠后肿瘤形成的潜伏期延长.结论:以上实验结果证实p16基因在鼻咽癌的发生过程中确实具有一定的作用,它的表达上调可以促进鼻咽癌细胞恶性表型的逆转.     

耐长春新碱视网膜母细胞瘤细胞株的建立

目的：研究视网膜母细胞瘤获得性多药耐药现象，探讨其产生机制。方法：利用长春新碱(vincristree，VCR)对人视网膜母细胞瘤细胞系HXO-RB₄₄细胞在体外进行浓度递增法逐步诱导实验，建立一株耐长春新碱视网膜母细胞瘤细胞亚株HXO—RB/VCR。并对其细胞生长，药物含量，药物敏感性与放射性敏感性进行检测。 结果：该耐药细胞株HXO—RB/VCR细胞对长春酰胺、丝裂霉素C、阿霉素、足叶乙甙、顺铂、卡铂等有交叉耐受，对卡氮芥、氟尿嘧啶无明显抗药性，而对氨甲喋呤的敏感性反而增加。对⁶⁰ Coγ射线有轻度耐受性。细胞内药物含量测定显示：耐药细胞内长春新碱浓度明显低于敏感细胞，钙通道阻断剂异博定可使细胞内VCR浓度增加，部分逆转其耐药性。 结论：VCR可诱导视网膜母细胞瘤产生多药耐药和轻度放射耐受，获得性多药耐药作用可被异博定逆转。 （中华眼底病杂志，1997，13：6-9）     

人体上皮细胞的原代培养

总结了人体上皮细胞的原代培养方法，详述了组织块培养法，单细胞分离培养法、成纤维细胞清除法及其关键技术，如以冷胰蛋白酶消化法制备各种上皮细胞悬液，用机械刮除加酶消法清除成纤维细胞。本资料有助于基础医学研究及在临床应用中获得理想的研究材料。     

D型周期素在鼻咽癌中的表达及功能分析的初步探讨

目的和方法 :肿瘤是一种细胞周期病。Ｄ型周期素是调节细胞周期Ｇ1 /Ｓ期进展的重要正性调节因子 ,包括Ｄ1、Ｄ2及Ｄ3三个亚型 ,尤其是Ｄ1已被证实是一种候选瘤基因。我们先前的研究已首次在鼻咽癌活检组织中建立了Ｄ型周期素的表达谱 ,发现Ｄ型周期素在鼻咽癌活检组织中呈差异性表达。新近的研究表明 ,在Ｂ淋巴细胞中ＥＢ病毒潜伏膜蛋白ＬＭＰ1能诱导Ｄ2的表达 ,协同Ｄ1调节Ｇ1 期行进。因此 ,在此基础上 ,本文利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法进一步检测了ＥＢＶ -ＬＭＰ1 ( )及 ( - )的鼻咽癌细胞系ＣＮＥ -ＬＭＰ1、ＨＮＥ1中…     

茶多酚诱导鼻咽癌细胞cyclin D1表达下调

目的：探索茶多酚及其单体抑制鼻咽癌增殖的分子机制。方法：应用光学显微镜、MTT测定、流式细胞仪、报告基因和Western blot分析等方法,研究茶多酚及其单体对细胞增殖和细胞周期的影响及分子机理。结果：茶多酚处理鼻咽癌细胞CNE1－LMP124h后,从裂相细胞显著减少,细胞增殖受到抑制,细胞的生存率从100％下降到38．1％（200μg/ml);S期细胞明显减少,从22．20％下降至13．16％（200μg/ml) ,G0/G1细胞所占百分率增加,从68．50％上升至74．08％,细胞出现G1／S阻滞,同时,cyclinD1基因启动子转录活性显著下调,与对照组比下降4－5倍,但相同浓度的茶多酚与（-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG)处理没有显著性差别,cyclinD1蛋白表达水平明显降低,采用荧光酶双报告基因系统分析,发现茶多酚处理12－14h后,AP－1、NFkB反式激活活性均匀显著下降,与对照组（0μg/ml)比分别下降5－6倍、7－8倍,且呈明显量效关系。结论：茶多酚能抑制鼻咽癌细胞CNE－LMP1增殖,茶多酚诱导致cyclinD1基因的转当和表达下调可能在其中起着重要作用。     

视网膜母细胞瘤细胞系HXO－Rb_（44）化疗敏感性及多药耐药性研究

对视网膜母细胞瘤细胞系ＨＸＯ－Ｒｂ４４进行１１种不同类抗癌药物的敏感性测试，显示该细胞系存在多药耐药现象。该细胞系在手术取材前及培养过程中，未接触过任何抗癌药物，提示这种多药耐药现象为该肿瘤细胞固有的。本研究为进一步探索视网膜母细胞瘤的化疗抗性，寻找新的抗癌靶点提供了理论依据。     

汉防己甲素对视网膜母细胞瘤细胞系HXO－Rb_（44）放射敏感性的影响

研究汉防己甲素（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ，ＴＤＲ）对人视网膜母细胞瘤细胞系ＨＸＯ－Ｒｂ４４放射敏感性的影响，发现ＴＤＲ在低剂量（０．１μｇ／ｍｌ）时，虽对Ｒｂ细胞无直接抑制作用，但可明显增加放射线对Ｒｂ细胞的杀伤作用。随着药物浓度的增加，细胞杀伤率增高。放射前后给药无明显差别。ＴＤＲ主要通过抑制细胞的潜在致死性损伤的修复增加放疗效果。