PHⅡ-7通过升高ROS诱导K562和K562/A02凋亡

目的探讨靛玉红衍生物——PHⅡ-7对K562和K562/A02的体外杀伤作用及其机制。方法利用WST-8试剂盒、细胞凋亡检测以及活性氧(ROS)检测研究PHⅡ-7对K562和K562/A02发生杀伤作用的机制。共聚焦显微镜及Western blot分析观察药物处理前后细胞的变化。结果细胞毒实验证实PHⅡ-7对K562和K562/A02有相近的杀伤作用。给予上述两种细胞2μmol·L-1PHⅡ-7可见明显的ROS水平升高。PHⅡ-7对K562及K562/A02具有诱导凋亡的作用,呈剂量依赖性。加入ROS的抑制剂NAC可抑制给药后细胞内ROS水平的提高,同时也抑制了PHⅡ-7处理后细胞的凋亡。共聚焦显微镜观察发现药物处理的K562和K562/A02细胞出现明显的凋亡形态改变,Western blot分析表明单用PHⅡ-7可以引起PARP-1及caspase-3,caspase-9的切割,当PHⅡ-7与NAC共同作用之后,上述改变均被抑制。结论 PHⅡ-7可以通过诱导K562/和K562/A02凋亡来实现对上述细胞的杀伤作用,该作用很有可能与其升高细胞内的ROS水平有关。     

突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建

目的:构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体.方法:首先利用RT-PCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原eDNA;然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上产生2个突变位点,使突变的eDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点,该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INS-M2;最后将INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上,并与骨架载体共转染至细菌内,通过细菌内同源重组得到重组载体.结果:HindⅢ和Xho I酶切、Poc I酶切及测序均证实载体pAd-INS-M2构建成功.结论:构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAd-INS-M2为进一步转染非胰岛β细胞,对糖尿病进行基因治疗奠定了基础.     

小肠结肠炎综合征小鼠肠黏膜中NLRP3表达与炎症分子关系的研究

目的 探讨食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征（FPIES）小鼠肠黏膜细胞中炎症小体NOD样受体热蛋白结 构域相关蛋白3（NLRP3）表达水平,明确NLRP3异常与炎症分子及细胞焦亡的关联性。方法 利用卵清蛋白灌胃建 立食物蛋白诱导FPIES小鼠模型;实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和Western blot方法检测肠黏膜细胞NLRP3、 炎症分子及细胞焦亡通路分子的表达水平;采用药物干预黏膜细胞,分别抑制和激活NLRP3,Western blot方法检测 肠黏膜细胞炎症分子及细胞焦亡通路分子表达的改变情况。结果 FPIES小鼠肠黏膜细胞中NLRP3、炎症分子及细 胞焦亡通路分子表达水平显著上调（P＜0.05）;激活NLRP3表达,可以诱导炎症分子及细胞焦亡通路分子表达显著 上调,抑制NLRP3表达,可以显著上调炎症分子转化生长因子（TGF）-β和肿瘤坏死因子（TNF）-α表达（P＜0.05）。结论 FPIES小鼠肠黏膜细胞NLRP3表达与炎症反应及细胞焦亡密切相关,是调控FPIES肠道病理表型的上游靶标分子。     

IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用

目的：构建以IL-3为靶向、力达霉素（lidamycin,LDM）为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。 方法: 原核表达IL-3-LDP（interleukin 3-lidamycin）融合蛋白,组装活性烯二炔（active enediyne,AE）发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系（KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji）表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。 结果: 组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）KG-1a细胞表面CD123阳性率最高（88.9%）,其次为MO7e和TF-1细胞（＞75%）,再次为HL-60细胞（7.8%）,而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞）的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星（adriamycin, ADR)的1 415.8倍,而IL-3-LDM 的杀伤强度又是LDM的9.6倍。 结论: IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM 并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。     

胰腺癌细胞可溶性分泌物对小鼠脂代谢的影响

目的 探讨胰腺癌细胞可溶性分泌物对体内脂肪代谢的影响。方法 利用无血清培养基培养胰腺癌 Panc-1、MiaPaCa-2、BxPC-3细胞24 h后留取上清制得胰腺癌细胞条件培养基。全实验包括两个子实验,实验A将 37只BALB/c小鼠随机分为对照组（n=14）,Panc-1组（n=10）,MiaPaC-2组（n=6）和BxPC-3组（n=7）,分别注射正常 DMEM培养基和3种胰腺癌细胞（Panc-1,MiaPaCa-2,BxPC-3）条件培养基,每组小鼠连续7 d接受培养基的皮下注 射,每日2次。监测每只小鼠进食量及体质量,检测血浆葡萄糖、三酰甘油含量和肝脏中糖原含量,酶联免疫吸附法 （ELISA）测定血浆胰岛素水平,小鼠的腹股沟脂肪垫（BAT）、附睾脂肪垫（WAT）予以称质量,Western blot检测脂肪中 脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）蛋白表达水平。实验B将30只BALB/c小鼠随机分为对照组（n=10）、1/2 M组（n=10）、M 组（n=10）,将正常DMEM培养基和不同剂量的MiaPaCa-2细胞条件培养基注射入对应组别小鼠体内,余处理与实验 A相同。结果 实验A中,小鼠进食量及体质量初期均下降,之后回升并趋于稳定,与对照组相比,MiaPaCa-2组和 BxPC-3组血浆胰岛素、血糖水平升高（P＜0.05）,肝糖原、三酰甘油水平下降（P＜0.05）,BAT和WAT质量增加（P＜ 0.05）,Panc-1组仅三酰甘油水平下降（P＜0.05）,3个胰腺癌细胞条件培养基注射组脂肪组织内ATGL表达水平均下 降（P＜0.05）;实验 B 中,与对照组相比,M 组血浆胰岛素和葡萄糖上升（P＜0.05）,肝糖原和三酰甘油均下降（P＜ 0.05）,BAT 和 WAT 质量增加（P＜0.05）,ATGL 表达水平下降（P＜0.05）,1/2 M 组仅胰岛素水平和脂肪垫质量上升 （P＜0.05）。结论 注射胰腺癌细胞条件培养基可造成小鼠体内脂肪代谢失衡,出现胰岛素抵抗、脂肪储存加强和脂 肪分解减弱的现象。     

Ras/MAPK与PI3K/Akt信号转导通路及其相互作用

Ras/MAPK通路和PI3K/Akt通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径,它们调节着细胞凋亡、生长以及一些重要基因的表达。在不同的细胞类型、不同的细胞分化时期、不同的实验条件下,PI3K/Akt通路和Ras/MAPK通路之间的相互作用都会十分明显地表现在这两条通路的不同阶段,这些为白血病和其他肿瘤的新治疗方案提供了重要的理论依据。现将PI3K/Akt和Ras/MAPK通路及其相互作用综述如下。     

脐带间充质干细胞运载scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白对B鄄淋巴瘤细胞的生长抑制作用

目的:探讨脐带间充质干细胞运载scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白的新型双重靶向系统对CD20+ BJAB 细胞的生长抑制作用。方法: 采用传统分子生物学技术构建pLenR scFvCD20:sTRAIL、pLenR ISZ-sTRAIL、pLenR scFvCD20 及pLenR copGFP 四种慢病毒表达载体,利用四质粒慢病毒包装系统于293T 细胞中包装慢病毒颗粒,并感染人脐带组织来源的MSCs(HUMSCs),使其稳定表达融合蛋白。于体外采用CCK8 细胞增殖抑制实验检测scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白对CD20 阳性BJAB 细胞和Raji 细胞、CD20 阴性Jurkat 细胞以及正常人外周血单个核细胞(PBMCs)的生长抑制作用。建立NOD/ SCID鼠BJAB 细胞皮下移植瘤模型,将MSC郾scFvCD20:sTRAIL 经尾静脉注射入小鼠体内,每3 d 测量瘤体积,根据肿瘤体积计算抑瘤率。结果:成功构建了慢病毒表达载体pLenR-scFvCD20:sTRAIL、pLenR-ISZ-sTRAIL、pLenR-scFvCD20 及pLenR copGFP,且经慢病毒感染可在HUMSCs 中稳定表达。体外实验显示,scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白可不同程度地提高对CD20 阳性BJAB和Raji 细胞的生长抑制作用,而对CD20 阴性Jurkat 细胞的生长抑制作用降低;而且不影响PBMCs 的生长。体内实验表明,MSC-scFvCD20:sTRAIL 可显著抑制BJAB 淋巴瘤的生长,初始治疗后第24 天,抑瘤率达65.2%,与MSC ISZ:sTRAIL 治疗组比较(抑瘤率为52.7%),具统计学差异(P<0.05)。结论:建立了HUMSCs 运载scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白的双重靶向治疗系统,HUMSCs 可向BJAB 淋巴瘤部位归巢并表达分泌scFvCD20:sTRAIL 融合蛋白,后者在局部经scFvCD20 的二次导向发挥CD20 特异性抑瘤作用。为MSCs 作为肿瘤靶向治疗载体在临床中的应用提供了理论依据。     

基因疫苗脾内免疫制备抗人c-kit单克隆抗体及其初步鉴定

目的：用基因脾内免疫方法制备抗人c-kil单克隆抗体，并通过对抗体生物学特性的初步研究，确定该方法制备抗体的可行性。方法：利用分子克隆方法构建重组质粒pcDNA3．1／c-kit胞外区，脾内免疫BALB／c小鼠一次，通过杂交瘤技术制备抗人c-kit单克隆抗体。采用流式细胞术、Western blot方法初步鉴定制备的抗体。结果：目的基因片段c-kit外区正确插入质粒pcDNA3．1，重组质粒免疫小鼠后通过杂交瘤技术获得了三株分泌抗人c-kit胞外区的杂交瘤细胞株6CA、2C5和5D5。其亚类均为IgM类，识别不同的抗原表位，其特异性与抗人c-kit抗体一致。结论：可用基因脾内一次免疫法制备抗人c-kit单克隆抗体。     

大黄酸增强低氧环境中效应T细胞的抗结肠癌活性

目的:验证中药有效成分大黄酸抑制低氧引起的结肠癌细胞中免疫抑制分子的表达,为大黄酸与效应T细胞的联合应用提供基础理论依据。方法:首先根据CCK-8检测大黄酸对结肠癌细胞系的细胞毒作用,选择恰当的研究浓度;然后用Western blot和q PCR检测在低氧条件下,一定浓度的大黄酸能否下调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和某些免疫抑制分子的水平;最后在我们自己建立的能够被T淋巴细胞特异识别杀伤的结肠癌细胞模型上,进一步检测大黄酸在低氧条件下对效应T细胞活性的影响。结果:与常氧对照组相比,低氧组、低氧+25μM大黄酸组和低氧+50μM大黄酸组细胞中程序性死亡受体-配体1(PD-L1)m RNA的相对量分别为1.63±0.29、0.80±0.17和0.47±0.12;半乳糖凝集素-1(galectin-1)m RNA的相对量分别为4.42±0.73、0.47±0.11和0.24±0.11。当效靶比为1:1、2:1和4:1时,T细胞对肿瘤细胞的杀伤百分率分别为(27.32±3.05)%、(42.68±3.69)%和(54.02±1.82)%;而低氧条件下,杀伤百分率分别下降至(21.53±3.74)%、(33.55±1.51)%和(45.20±2.27)%;在低氧条件下加入50μM大黄酸,杀伤百分率又分别升高至(32.70±2.37)%、(47.01±3.15)%和(57.26±1.12)%,各组之间有显著性差异(P0.05)。结论:一定浓度的大黄酸能够降低低氧引起的免疫抑制分子表达升高,并且可以逆转由于低氧产生的效应T细胞活性下降。大黄酸有望与T细胞过继免疫疗法联合使用,用于结肠癌的治疗。