以CRSIPR/Cas9 技术删除CTLA-4 后CTL抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果

目的：探讨使用CRSIPR/Cas9 技术删除CTL的免疫检查点CTLA-4 后CTL的抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果及其作用机制。方法：针对CTLA-4 设计特异性小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)并构建sgRNA/Cas9 质粒，使用慢病毒载体转染质粒至CTL获得删除CTLA-4 的CTL（CTLA-4 KOCTL），并验证质粒的转染效率和CTLA-4 的删除效率。BALB/c裸鼠随机分为2 组进行实验，预防性注射CTLA-4 KO CTL（实验组）及CTL（对照组），3 d 后接种结肠癌细胞株LS174-T，观察成瘤率及成瘤时间。建立结肠癌移植瘤裸鼠模型，成瘤后裸鼠随机分为2 组，分别给予CTLA-4 KO CTL（实验组）及CTL（对照组）进行细胞治疗，观察移植瘤的体积、裸鼠的生存时间，并检测移植瘤裸鼠血清中TNF-α 及IFN-γ 分泌水平。结果：设计sgRNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9 系统，使用构建好的CRSIPR/Cas9 系统转染CTL细胞，转染效率最高可达（28.80±0.62)%，转染后以流式细胞术检测CTLA-4 的删除效率，CTLA-4 KO CTL 组的CTLA-4 表达较CTL 组显著降低[ （0.91±0.25）% vs（42.70±2.72）%，P<0.01]。预防实验中，实验组结肠癌移植瘤发生率明显低于对照组（33.33% vs 100.00%，P<0.01）。治疗实验中，实验组肿瘤体积较对照组显著减少[ （503.0±23.9）vs（911.2±51.4）mm3，P<0.05]，实验组裸鼠相较于对照组生存时间明显延长（中位生存期：78 vs 42 d，P<0.05），实验组裸鼠血清TNF-α（[ 268.93±17.04）vs（148.26±20.07）pg/ml，P<0.05]及IFN-γ（[ 315.38±18.67）vs (202.92±29.32) pg/ml，P<0.05]的分泌水平较对照组明显增高。结论：以CRSIPR/Cas9 技术成功删除CTL中免疫检查点CTLA-4 后可以显著抑制裸鼠结肠癌移植瘤的成瘤率、增强CTL对荷结肠癌裸鼠的抗肿瘤作用，并明显增高荷瘤鼠血清中TNF-α 和IFN-γ 水平。