mRNA转染树突细胞协同CIK细胞体内抗肿瘤作用的研究

目的:研究人肺腺癌细胞系SPC-Al mRNA基因转染的树突状细胞(dendritic cells, DCs)和细胞因子诱导活化杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)体内协同抗瘤活性.方法:按常规方法分离健康人外周血单个核细胞,并分别诱导培养为DC和CIK细胞.将人肺腺癌细胞mRNA转染DC细胞,并将转染后成熟DC与CIK细胞混合培养,流式细胞仪检测混合培养前后的CIK细胞表型变化,并通过建立人肺腺癌细胞移植模型研究其体内的协同抗肿瘤活性.结果:混合培养后的CIK细胞表面CD3 CD8 及CD3 CD56 表达显著升高,P<0.01;共孵育后的mRNA-DC-CIK细胞组与其余各组相比,体内肿瘤抑制效率明显增大.结论:利用该方法来负载DC瘤苗具有可行性,为临床上解决DC瘤苗因肿瘤抗原的来源困难问题及提高CIK细胞的特异性抗肿瘤活性提供实验依据,为肺癌的治疗开辟一种新的有效的免疫治疗策略.     

自体肿瘤抗原负载DC-CIK细胞治疗胃癌的疗效分析

目的:探讨自体肿瘤抗原负载树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)治疗胃癌的疗效及安全性.方法:回顾性分析2005年1月至2010年1月在福建省肿瘤医院行胃癌切除术患者270例,根据是否进行DC-CIK治疗,分为对照组(150例)和DC-CIK治疗组(120例).应用流式细胞术分析DC-CIK细胞表型,比较两组患者的总生存期(OS),观察DC-CIK治疗的不良反应,Cox回归法分析胃癌预后影响因素.结果:成熟DC中HLA-DR+、CD8+、CD83+和CD86+的细胞比例分别为(96.16±1.51)％、(96.58±2.66)％、(96.44±2.20)％和(98.74±0.76)％.CIK中CD3+、CD3+ CD4+、CD3+CD8+和CD3+ CD16+/CD56+的细胞比例分别为(91.98 ±-5.9)％、(25.19±10.5)％、(71.15±7.8)％和(18.73±7.4)％.DC-CIK治疗组中位OS为77个月,与对照组的51个月相比差异明显(x2=4.431,P=0.035).DC-CIK治疗、辅助化疗和TNM分期是胃癌预后的独立影响因素.DC-CIK治疗的常见不良反应为发热、寒战和乏力.结论:胃癌术后应用自体肿瘤抗原负载DC-CIK治疗可延长胃癌患者的OS,且不良反应轻,安全有效.     

人热休克蛋白对树突状细胞表面共刺激分子表达影响的研究

目的:研究人热休克肿瘤抗原复合物对树突状细胞(dendritic cells,DC)表面共刺激分子表达的影响。方法:分离培养人外周血来源的DC细胞,在培养过程中加入分离纯化的人热休克蛋白70(HSP70)抗原复合物及肿瘤细胞裂解物,流式细胞技术分析比较负载HSP70肿瘤抗原复合物、负载肿瘤细胞裂解物及负载前DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86及HLA-DR表达水平的变化。结果:培养基中加入HSP70肿瘤抗原复合物后,其表面共刺激分子CD80、CD86和成熟标记分子CD83的表达水平分别为(98.9±1.5)%、(98.3±1.3)%和(53.1±0.8)%,与负载前CD80、CD86和CD83的(66.2±1.6)%、(94.2±2.0)%和(16.3±1.4)%相比显著提高,P=0.013;与肿瘤细胞裂解物负载的DC表面CD80、CD86和CD83的(86.2±1.9)%、(96.5±1.1)%和(55.1±1.0)%相比,共刺激分子CD80的表达显著提高,P=0.020。结论:人热休克肿瘤抗原复合物可提高DC表面共刺激分子的表达水平,促进DC功能活化,有可能在抗肿瘤免疫机制中起重要作用。     

5-Aza-CdR 联合EBNA1-DC 疫苗诱导的淋巴细胞对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用

目的：探讨EB病毒核抗原1（EBNA1） mRNA修饰的DC（EBNA1-DC）诱导的淋巴细胞联合甲基化抑制剂5-Aza-CdR对鼻咽癌C666-1细胞的杀伤作用。方法：以构建的EBNA1-pCDNA3.1质粒为模板,体外转录获得EBNA1 mRNA,通过脂质体转染至健康人外周血来源DC,构建EBNA1-DC疫苗。流式细胞术检测转染后DC表型及5-Aza-CdR 处理后的C666-1 细胞凋亡情况。实时无标记动态细胞分析技术检测EBNA1-DC 疫苗诱导的淋巴细胞联合5-Aza-CdR 的特异性抗肿瘤活性。结果：转染EBNA1 mRNA 后EBNA1-DC 表面EBNA1 阳性率为（59.3±5.85）%,HLA-DR 的表达与未转染DC 相比显著升高[（84.9±5.5）% vs（68.0±5.8）%,P=0.026],CD80 的表达也显著升高[（88.2±3.9）% vs （61.1±4.4）%,P=0.015]。低剂量5-Aza-CdR 处理后的C666-1细胞凋亡情况与未处理的细胞相比无显著差异。经低浓度5-Aza-CdR 预处理的C666-1细胞中IRF7基因表达与未处理的细胞相比显著升高（P=0.000 1）。与空载的DC相比,EBNA1-DC诱导的淋巴细胞对EBV 阳性表达的C666-1细胞具有更强的特异性杀伤活性（P=0.049）;经低浓度5-Aza-CdR 预处理的C666-1 细胞对EBNA1-DC 诱导的特异性免疫杀伤更敏感（P=0.019）。结论：5-Aza-CdR 与EBNA1-DC疫苗联合可显著增强对C666-1细胞的特异性免疫杀伤,本研究为开拓以mRNA为基础的DC疫苗及其在临床综合治疗中的应用转化提供前期研究基础。     

NK细胞高选择性扩增及其对移植瘤生长抑制作用

[目的]建立一种NK细胞体外选择性高效扩增的实验体系,观察其体内的抗肿瘤活性.[方法]以干细胞培养基(SCGM)为培养基,在低剂量IL-2(100 U/m1)联合14 mer肽TKD(TKDNNLLGRFELSG,aa450-463)(2μg/ml)的培养条件下,从人外周血PBMC中高效扩增获得CD3-CD56+NK细胞,并建立肝癌裸鼠移植瘤模型,观察NK细胞在体内的抗肿瘤活性.[结果]建立了一种高效的从人外周血PBMC中选择性扩增NK细胞的体系,该NK细胞对表面表达HSP70的肝癌移植瘤模型具有显著的抗肿瘤作用.[结论]经过14 mer肽TKD激活的NK细胞对表面表达HSP70的肿瘤具有很强的溶解活性.     

长期传代人脐带间充质干细胞的特性及功能

目的：探讨传至10 代（P10）的人脐带来源间充质干细胞（P10-hUC-MSC）的生物学特性及功能。方法：人脐带来源于厦门弘爱医院（伦理批号：HAXM-MEC-20201012-037-01），分离、收集、培养hUC-MSC 并传代培养，收集P1-、P10-hUC-MSC， FCM检测hUC-MSC 表型，细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法及FCM法检测终末期细胞衰老与凋亡情况，秋水仙碱处理检测细胞染色体稳定性，体外成脂、成骨诱导实验检测其多向分化能力，以不同比例与外周血单个核细胞（PBMC）混合培养后FCM检测T细胞亚群及表型变化。结果：成功分离和培养的P10-hUC-MSC与P1-hUC-MSC 的表型相似，表现为CD45、CD34、HLA-DR表达阴性而CD105、CD90 阳性率 95%。终末期的P1-hUC-MSC 和P10-hUC-MSC 均表现出β-半乳糖苷酶表达阳性和早期凋亡特征，细胞染色体核型一致且保持稳定，未发生转化现象。P1-、P10-hUC-MSC在体外都可被诱导分化成脂肪、成骨细胞。P10-hUC-MSC与PBMC 以1∶1 混合培养7 d 后，可显著上调CD4+/CD8+ T细胞比值、CD4+ Treg 细胞比例和PD-1表达（均P<0.01）。结论：长期传代的P10-hUC-MSC仍然保持其生物学特性和安全性，并具备多向分化能力及免疫调节能力，这为最大限度发挥hUC-MSC的临床放疗损伤修复与预防作用提供了前期实验依据和指导。