竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆竹节参Panax japonicus鲨烯环氧酶基因（squalene epoxidase,PjSE）的全长cDNA序列,进行生物信息学分析和原核表达。方法 设计特异性引物,从竹节参中克隆得到PjSE序列;以PjSE基因序列作为输入数据,利用多序列同源比对等生物信息学分析工具进行序列分析;构建重组原核表达载体pCold-PjSE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在竹节参不同组织中的相对表达量。结果 PjSE基因开放阅读框长度为1884 bp,编码627个氨基酸,PjSE蛋白相对分子质量为68 639.49,初步预测其具有跨膜结构域,可能定位在叶绿体上;聚丙烯凝胶电泳结果显示诱导表达蛋白的相对分子质量大小与预期结果一致;该基因在竹节参叶中表达量最高,须根次之,根中表达量最低。结论 PjSE基因的克隆、生信分析及原核表达研究,不仅有助于丰富竹节参中该类功能蛋白的种类和数量,完善竹节参皂苷类成分的生物合成途径,也为后期开展竹节参皂苷的异源合成提供了可供选择的关键基因元件。     

TP53基因沉默介导PI3K/PTEN/AKT信号通路对肾透明细胞癌侵袭转移的调控机制

目的探讨肿瘤蛋白p53基因(TP53)沉默介导PI3K/PTEN/AKT信号通路对肾透明细胞癌侵袭转移的调控机制。方法取60例肾透明细胞癌组织标本,免疫组化分析TP53蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达;取人肾透明细胞癌细胞株RLC-310进行细胞培养;细胞转染表达载体分为空白组(A组)、阴性对照组(B组)、sh TP53组(C组)、PTEN抑制剂bpv组(D组)、phen+sh TP53组(E组)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot检测各组细胞TP53、同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、AKT的m RNA和蛋白表达水平;CCK-8法检测各组细胞增殖能力;划痕愈合试验检测各组细胞的迁移能力;Transwell侵袭试验检测各组细胞的侵袭能力。结果TP53蛋白在肾透明细胞癌组织中高表达(P<0.05);与A组和B组相比,C组的TP53,PI3K,AKT m RNA和蛋白表达水平显著下降,PTEN m RNA和蛋白表达水平均显著上升,且细胞增殖能力、迁移率、侵袭率均显著下降(P<0.05);D组TP53,PI3K,AKT m RNA和蛋白表达水平显著上升,PTEN m RNA和蛋白表达水平显著下降,且细胞增殖能力、迁移率、侵袭率均显著上升(P<0.05);同时,E组TP53下降(P<0.05),而其他指标与A组和B组相当(P>0.05)。结论沉默TP53基因抑制PI3K/PTEN/AKT信号通路,从而抑制肾透明细胞癌细胞浸润转移功能,并可逆转phen诱导的肾透明细胞癌细胞浸润转移。