METase在不同原核表达系统中的表达和活性比较

目的：构建L-蛋氨酸γ-裂解酶（Metase）基因的两种高效原核表达载体，建立最佳高效原核表达体系。方法：在Metase基因已经克隆的基础上，通过分子克隆技术构建两种重组表达质粒pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,重组质粒转化感受态大肠杆菌Dh5α,诱导表达，测定Metase活性，统计分析比较。结果：成功构建出两种高效重组表达质粒pBV220-Metase和pGEX-4T-1-Metase,经诱导后都能测出Metase活性。结果：重组表达质粒pBV220-Metase具有比pGEX-4T-1-Metase更强的活性，可作为Metase的高效表达体系。     

hB7-1重组腺病毒感染的肿瘤细胞的生物学特性

目的 在完成hB7-1 cDNA克隆并成功构建包含hB7-1基因的重组腺病毒rAdexl-B7－1的基础上,对经rAdexl-B7－1感染的B16细胞的体外生物学特性进行了研究。方法 以FACS、电镜等方法观察病毒感染前后B16细胞的变化。结果 ①重组腺病毒经KEK293细胞扩增、CsCl纯化后滴度可达10^10ＰＦＵ／ml,且２０ＭＯＩ的病毒可使９５％以上的Ｂ１６细胞被感染。②细胞动力学研究显示,rAdexl-B7-1对Ｂ１６的生长及集落形成能力无影响。③ＦＡＣＳ结果表明,rAdexl-B7-1细胞的增殖周期无影响。④扫描电镜及透射电镜结果表明,经rAdexl-B7-1感染的Ｂ１６细胞在表面形态及超微结构上出现变化。结论 重组腺病毒rAdexl-B7-1对Ｂ１６细胞的生长动力学无影响,对形态学有轻微影响。     

癌基因治疗中的腺病毒载体的开发和应用(综述Ⅲ)

3 大容量腺病毒载体的开发3.1 新型腺病毒辅助细胞系和相关载体的开发 作为复制缺陷型和不依赖于辅助病毒的腺病毒载体系统的一部分,辅助细胞系显得非常重要。一般来说,这个工作是通过把更多的Ad基因或基因组区域放到细胞里来提高反义互补的容量。在这条原则下成功研制的新型Ad载体有如下几点益处,如增加基因携带容量,减少产生RCA的可能性以及减少载体的免疫原性。然而目前的问题是在新的辅     

人IL—4基因质粒的构建及其在DOS细胞的表达

用ＰＨＡ活化人外周血单个核细胞提取ｍＲＮＡ，建立了ｃＤＮＡ文库，将其与人工合成的人ＩＬ－４针杂交，解离了一段ＤＮＡ序列，将其插入πＨ３Ｍ质粒，然后转化猴的ＣＯＳ细胞，经流式细胞仪测定证实表达细胞的培养上清中具有较高的人ＩＬ－４的生物学活性。     

蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体构建

目的构建蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体.方法运用Cre-LoxP重组酶系统,通过DNA重组技术,将L-蛋氨酸-γ裂解酶基因(L-Methioneγ-Lyase Gene)与供体载体pDNR-CMV重组,获得含有Metase重组基因的供体载体pDNR-Metase-CMV.将pDNR-Metase-CMV片段与真核腺病毒载体PLP-Ade-X-CMV进行重组,获得pLP-Ade-Metase-CMV重组分子.结果获得了重组腺病毒载体pLP-Ade-Metase-CMV,并证实该重组腺病毒载体中有Metase Gene.结论采用LoxP/Cre体外重组法成功地构建了含蛋氨酸酶基因的真核表达重组腺病毒载体.     

2种重组真核蛋氨酸酶原核体系表达及活性比较

目的构建2种真核L-蛋氨酸γ-裂解酶(MGL1 MGL2)的高效原核表达载体,诱导表达及纯化,比较活性差异.方法通过分子克隆技术构建2种重组表达质粒pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2;重组质粒转化感受态大肠杆菌Dh5α,诱导表达纯化蛋氨酸酶.结果构建了高效表达载体pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2;pGEX-4T-1-MGL1表达的酶纯度为82.5%,活性为0.505 2 IU/mg,pGEX-4T-1-MGL2表达的酶纯度为81.4%,活性为0.305 2 IU/mg.结论 pGEX-4T-1-MGL1,pGEX-4T-1-MGL2都能表达蛋氨酸酶;pGEX-4T-1-MGL1表达的蛋氨酸酶纯度比较高,酶活性比较高.     

人CD80重组腺病毒感染的肺癌细胞的生物学特性

目的：研究c-myc对人端粒酶逆转录酶（htert）启动子的调节作用。方法：采用Lipofect脂质体转染法将DNA质粒分别转染至肝癌细胞HepG2、猴肾COS－7细胞和NIH3T3细胞,孵育48h后,分别检测其报告基因萤虫素酶活性。结果：与对照组相比,载有htert80bp启动子的质粒TERTLuc(800)在肿瘤细胞HepG2中活性显著增强。外源性转因子c-myc可显著上调htert启动子的表达,其激活作用与剂量呈正相关。人工突变c-myc结合位点明显降低htert启动子的活性。结论 ：c-myc可直接激活ht ert启动子的表达,是调节端粒酶活性的重要转录因子。     

人IL-2重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性及体内抗肿瘤研究

目的 :研究感染hIL 2重组病毒的人肺腺癌细胞 (Anip973)的体外生物学特性及小鼠体内抗肿瘤作用。方法 :将携带有hIL 2基因的重组腺病毒 (rAd hIL 2 )感染人肺腺癌细胞系 ,通过细胞生长实验、克隆形成实验等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用 ;利用PCR技术对转染后的细胞进行检测并应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL 2的分泌量 ;通过肿瘤局部注射rAd hIL 2的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果 :rAd hIL 2经扩增、纯化后 ,滴度可达 10 1 0 PFU ml,当病毒量为30MOI时 ,对Anip973细胞的转染率达 90 %以上。转染的Anip973肿瘤细胞其生长能力、克隆形成率等无明显变化。 2 4小时细胞培养上清IL 2的分泌量为 2 0pg 1ml 2× 10 5细胞。体内实验表明注射rAd hIL 2的小鼠肿瘤生长缓慢 ,体积明显小于对照组 (P <0 0 5 ) ,生存期显著延长。结论 :腺病毒介导的细胞因子基因hIL 2转染的Anip973肿瘤细胞体外生物学特性未见明显变化 ,而体内实验则有明显的抗肿瘤作用。     

重组腺病毒抗小鼠移植瘤生长

目的:研究携带细胞因子基因hIL-2、hTNF-a的重组腺病毒对小鼠移植瘤生长抑制作用。方法:将分别携带有hIL-2基因、hTNF-a基因的重组腺病毒感染人肺腺癌Anip973细胞系,应用ELISA试剂盒检测转染后的细胞IL-2、TNF-α的分泌量;通过肿瘤局部注射重组腺病毒的方法观察其在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果:转基因的肿瘤细胞生长能力、克隆形成率等无明显变化。24h细胞培养上清IL-2的分泌量为50pg/2×105细胞,TNF-α的分泌量为20pg/2×105细胞。体内实验表明注射重组腺病毒后小鼠肿瘤生长缓慢,体积明显小于对照组(P<0.05),存活期显著延长。结论:瘤内注射重组腺病毒具有明显抗肿瘤作用。