膜荚黄芪3个苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

目的克隆膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因家族成员,分析它们在不同组织中的表达模式与毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量变化,为揭示膜荚黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累的分子机制提供理论依据。方法以膜荚黄芪总RNA为模板,采用同源克隆法和RACE技术克隆PAL基因并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术测定PAL基因在根、茎、叶中的表达量;采用HPLC法测定了根、茎、叶中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。结果从膜荚黄芪中克隆了3个PAL基因Am PAL1、Am PAL2、Am PAL3,Genbank登陆号分别为KY086279、KY086280、KY086281。Am PAL1、Am PAL2和Am PAL3的全长c DNA长度分别为2 508、2 401、2 498 bp,均含有2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸。蛋白质序列分析表明,它们均含典型的PAL酶活中心序列,与植物PAL蛋白同源,且与同属于豆科的植物PAL蛋白相似性最高。系统进化树表明,Am PAL1与Am PAL2和Am PAL3聚为不同的亚类。实时荧光定量PCR分析发现,这些基因在根、茎、叶中表达模式不同,在检测的所有组织中Am PAL1的表达量最高、Am PAL2的表达量次之、Am PAL3的表达量最低,只有Am PAL2的表达水平与毛蕊异黄酮葡萄糖苷积累变化一致(即根茎叶)。结论从膜荚黄芪中克隆的Am PAL1、Am PAL2和Am PAL3是典型的PAL基因家族成员,推测它们在膜荚黄芪各组织发育过程中起着不同的作用,且Am PAL2可能参与了毛蕊异黄酮葡萄糖苷的积累。