海洋来源的D-海因酶产生菌的分离及酶催化通道模拟分析

为获取全新来源并具有潜在高性能的海因酶,本研究通过对海洋沉积物进行以D-对羟基苯海因作为唯一氮源的选择培养基对潜在菌株进行初步筛选,然后通过双层琼脂法和微孔快速筛选法对初筛菌株进行复筛,并结合分子生物学筛选方法进行终筛,最终得到桔橙小单胞菌(Micromonospora aurantiaca,GenBank登录号:FJ547135.1)、金色链霉菌(Streptomnyces aureofaciens,GenBank登录号:AB326923.1)、桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii,GenBank登录号:GU238264.1)和链霉菌7-145(Streptomyces sp.7-145,GenBank登录号:JQ782979.2)4株产D-海因酶的阳性链霉菌.用兼并引物扩增4株阳性菌中的D-海因酶表达序列,转化大肠杆菌(Escherichia coli),并构建表达相应D-海因酶的工程菌株E.coli S1、E.coli S14、E.coli S29和E.coliS 145,提纯4种D-海因酶,并测定酶的酶活和动力学参数.结果显示,链霉菌7-145菌株中表达的海因酶活性最高,比活力为9.7 U/mg,催化速度常数Kcat=3.2x106/s,Km=9.5 mmol/L.最后利用Swiss-model软件对其进行在线同源模建和Caver Analyst软件对链霉菌7-145菌株来源的海因酶的催化通道进行结构模拟分析.模拟分析结果显示,本研究中D-海因酶的主要催化通道Tunnel 1长度为9.1(A),瓶颈氨基酸残基为59位的组氨酸、181位的组氨酸和313位的谷氨酸,瓶颈半径为2.18 (A);潜在的催化通道Tunnel 2长度为13.6(A),瓶颈氨基酸为62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸,瓶颈半径为1.52(A).如果对Tunnel 2通道中的62位的苏氨酸、93位的天冬酰胺和107位的色氨酸进行定点突变,有望开发出一种性能更优的D-海因酶.本研究提供了一种全新的海因酶阳性菌筛选体系,通过计算机模拟手段能够更直观了解海因酶的催化机制,为进一步获得性能更优的海因酶奠定基础.     

刺五加总RNA提取方法的比较

为了获取到高质量的刺五加总RNA,以叶片为试材,比较不同提取方法的提取效果。结果表明,改良的异硫氰酸胍法效果最优,方法简单、经济,通过该方法获得的总RNA能够很好的满足后续分子生物学实验的要求,试剂盒方法效果次之,CTAB法效果第三,Trizol法最差。