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目的构建虎眼万年青 EST 文库,筛选相关基因并对其进行功能鉴定。方法 CTAB 法提取虎眼万年青鳞茎总 RNA,通过SMART 方法构建全长 cDNA 文库,获得库容大于3×106 cfu/ml 的均一化全长 cDNA 文库。随机挑取1440个单克隆测序,并对得到的 EST 序列进行 Blast 分析（NR、NT、Swiss-Prot 和 KEGG）以及 COG 功能分类。结果获得1398条有效 EST 序列,含有1146条单一基因,cDNA 文库平均插入片段长度在1.5 kb 以上,全长率54%,冗余率3.3%。其中两段基因都与 Syntaxin 43基因相似,同源性分别为76%和89%,根据 Blast 比对结果,推断这两个基因片段是同一个 Syntaxin 基因的5'端和3'端。据此设计引物,以虎眼万年青 cDNA 为模板,通过常规的 RT-PCR 扩增得到全长 Syntaxin 基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体,接着导入大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE 和 Western blot 证实该基因在大肠杆菌获得表达。结论首次构建成功虎眼万年青 EST 文库;并从中筛选得到一条和 Syntaxin 具有同源性的基因,实现了 Syntaxin 蛋白在大肠杆菌中的表达,为 Syntaxin 基因功能的鉴定奠定基础。 相似文献
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天然药物合成生物学技术是一种采用多基因控制的方式,实现天然产物代谢途径在异源底盘细胞中的重构。启动子是调控基因表达的一种顺式元件,对多基因控制的代谢途径的平衡起着重要的作用。为了筛选获得性能优越的启动子用于多基因控制的代谢途径,一个基于红色荧光蛋白的酵母检测质粒被构建。首先,根据已经发表的红色荧光蛋白基因,设计并合成了一系列引物,通过连续重叠PCR的方法合成了全长红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer,并将该红色荧光蛋白基因导入酿酒酵母,SDS-PAGE、Western blot以及荧光显微镜观察都表明该红色荧光蛋白基因在酿酒酵母中获得了表达。然后,将具备功能的DsRed-Monomer基因与酿酒酵母表达载体pGBT9进行重组,获得能进行启动子文库筛选的启动子检测质粒pGBT9Red。为了检测该质粒的效能,通过PCR从酿酒酵母基因组中克隆得到了6种启动子(包括4种诱导型启动子和2种组成型启动子),并将6种启动子分别克隆到pGBT9Red中,置于红色荧光蛋白基因DsRed-Monomer上游,通过荧光成像确定启动子对红色荧光蛋白基因表达的调控效率。结果表明,6种启动子(GAL1、GAL2、GAL7、GAL10、TEF2和PGK1)在酿酒酵母中均能调控DsRed-Monomer的表达。该检测质粒的成功构建为进一步进行启动子活性分析和启动子元件文库筛选奠定基础。 相似文献
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OSW-1是20世纪90年代日本科学家从虎眼万年青（Ornithogalum saundersiae）球茎中分离得到的一种甾体皂苷类物质[1]，结构见图1。细胞水平活性测试研究发现， OSW-1对 HL-60的 IC50能达到0.25 nmol/L，而相同的实验中临床使用的依托泊苷（etoposide）、甲氨蝶呤（MTX）、阿霉素（ADM）依次为25、7.2和12 nmol/L，此外其对某些耐药的细胞株（如 P388/CPT）仍有效[2]。还有研究显示该化合物具有较好的安全性，对正常细胞的 IC50是癌细胞的30倍[3]。在动物水平，体内0.01 mg/kg OSW-1的摄入量能延长 P388小鼠存活期59%[2]。OSW-1不仅具有超强的抗癌活性，较广的抗癌谱，而且使用安全，是理想的临床候选药物，然而由于其获得不易，限制了对其的进一步研究开发。本文拟从 OSW-1的化学全合成、构效关系、药理作用机制等方面一一介绍。 相似文献
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3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶(HMGL)是一种参与生物体内3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)代谢的重要酶类,在自然界中广泛存在,具有多种功能。作为HMGL作用的前体物质,HMG-CoA在生物体内主要有两方面作用。首先,HMG-CoA可在HMGL作用下形成酮体,酮体能够提供能量;其次,作为甲羟戊酸途径中一个重要中间体,可用于合成甾体、辅酶Q、萜类等生命活性物 相似文献
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