小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

高交感活性诱导的大鼠心肌损伤模型中氧化应激的受体调控机制*

 目的：研究高交感活性诱发大鼠心肌损伤的氧化应激受体调控机制。方法：Sprague-Dawley (SD)大鼠随机分为对照组、模型组、普萘洛尔（Pro) 组、哌唑嗪(Praz)组、普萘洛尔+哌唑嗪 (Pro+Praz) 组、维生素E(VE)组及普萘洛尔+哌唑嗪+维生素E (Pro+Praz+VE) 组,除对照组外其余各组均腹腔注射去甲肾上腺素(NE) 复制高交感活性引起的心肌损伤模型,同时灌胃给予相应药物,连续给药16 d,期间监测各组动物体重的变化。16 d后进行心室重构指标（心指数和羟脯氨酸含量）、病理组织学检查、氧化/抗氧化指标（MDA、SOD、CAT、GSH-Px和T-AOC）和能量代谢指标（Na+-K+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase）分析。结果：从第9天开始,模型组动物体重与对照组的比较差异有统计学意义（P<0.05）,心指数和左心室肥厚明显增加,氧化/抗氧化和能量代谢障碍;Pro、Praz、Pro+Praz和VE各组均出现不同程度的动物体重、心指数、左心室肥厚和氧化/抗氧化失衡的改善;Pro、Praz和Pro+Praz能明显升高左心室Na+-K+ATPase和Ca2+-Mg2+ATPase的活性,Pro+Praz作用最明显（P<0.05）。结论：肾上腺素受体依赖是高交感活性诱导心肌氧化应激损伤的重要途径。     

细菌壁缺陷对沙门菌代谢特性影响

目的了解细胞壁缺陷沙门菌的代谢特性、某些酶活性及化学构成的特点,探讨细胞壁缺陷对沙门菌代谢的影响及其可能机制.方法定量检测与分析伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌及其经L型变异后形成的细胞突变株(CWDM)和伤寒沙门菌CWDM返祖菌的细胞裂解物中无机离子磷(PO43-)、镁(Mg2+)、钙(Ca2+)、及总蛋白、三酰甘油(TG)、胆固醇(Tch)含量及某些代谢酶的活性,用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)检测伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的细菌型、CWDMs及伤寒沙门菌CWDM返祖菌的乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶同功酶.结果沙门菌CWDMs的PO43-、Mg2+、Ca2+含量明显低于其亲代细菌型和伤寒沙门菌粗糙型返祖菌( P＜0.01).两菌的CWDMs均可检测出Tch和TG,而其亲代细菌型及伤寒沙门菌返祖菌则不能检出Tch和TG.代谢酶活性检测显示两菌的CWDMs乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)的活性明显低于其亲代细菌型或返祖菌(P＜0.01).PAGE检测显示两菌的CWDMs及其亲代细菌型和伤寒沙门菌返祖菌均具有乳酸脱氧酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)同功酶活性,细菌型及返祖菌有4种不同泳动速率的LDH同功酶,CWDMs仅显示2种快泳动的LDH同功酶,但缺乏慢泳动的2种LDH同功酶.两菌的细菌型和伤寒沙门菌粗糙型返祖菌经PAGE电泳可见一条漫泳动MDH同功酶带,CWDMs电泳后可见快慢泳动2条MDH同功酶带.分光光度法检测证实,细菌型与粗糙型的MDH活性相似;CWDMs的活性则明显较低.结论细胞壁缺陷可导致沙门菌的多种代谢酶活性及某些离子含量明显降低,具有与其亲代细菌型不相同的乳酸脱氧酶同功酶和苹果酸脱氨酶同功酶谱以发显著的Tch和TG代谢活性.由于沙门菌的细胞壁缺陷突变株在获得外源遗传物质时能够有规律地返祖并恢复与其亲代细菌型相同的各种代谢特性,提示细胞壁缺陷所导致沙门菌的代谢改变极可能与相关基因的的表达被抑制或开放有关.在沙门菌的染色体上可能存在有胆固醇代谢等基因,也可能是由于细胞壁缺陷导致了沙门菌的基因发生重排.     

人硫氧还蛋白1在大肠杆菌中的重组表达及其对高糖导致的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

目的 克隆人硫氧还蛋白1(hTRX1)基因并构建其原核表达载体,获得重组人硫氧还蛋白1(rhTRX1),评价rhTRX1对高糖导致的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用.方法 采用逆转录PCR方法扩增hTRX1基因片段,插入pET22b(+)质粒并转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),获得工程菌Rosetta-gami(2)-pET22ab(+)/hTRX1.用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定重组蛋白的正确性,用镍亲和层析纯化重组蛋白.采用高糖制备HUVEC损伤模型,MTT比色法检测HUVEC的存活率,生化方法测定HUVEC中乳酸脱氢酶(LDH)的外漏率以及细胞上清液中一氧化氮(NO)的水平.结果 构建的工程菌及其产生的重组蛋白rhTRX1正确.与正常对照组比较,高糖损伤组HUVEC的存活率降低、LDH外漏率明显升高,NO的水平明显地降低.不同剂量rhTRX1处理组HUVEC的存活率升高、LDH的外漏率明显降低,NO的水平明显地升高.结论 成功克隆并在大肠杆菌中表达rhTRX1、获得结构正确的rhTRX1,rhTRX1对高糖诱导的HUVEC损伤具有保护作用.     

mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究

目的构建小鼠β防御素1和β-防御素3（mBD1,mBD3）融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用。方法通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoRI和Xho工双酶切后插入相同酶切的pcDNA3．1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT—PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBDl-mBD3的表达。用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD1—mBD3。RT—PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达。实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用。结论本研究成功构建了pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有-定的抗流感病毒作用。为进-步深入研究mBDI-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础。     

川参通注射液与头孢唑林配伍的抗菌活性观察

目的：观察川参通注射液与头孢唑林钠注射液配伍的抗菌活性及稳定性。方法：将川参通注射液与头孢唑林钠注射液混合，以分光光度仪检测其吸收度值和以最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)试验检测其对葡萄球菌和淋病奈瑟菌的抑菌和杀菌活性。结果：川参通注射液与头孢唑林钠注射液的配伍剂为棕色澄清液体，无沉淀、混浊或絮状物，405nm波长处的吸收度值小于川参通注射液的吸收度值。抑菌及杀菌试验结果显示配伍剂的抗菌活性较川参通注射液或头孢唑林钠注射液单独使用的活性显著增高，其中对金黄色葡萄球菌的MIC为0．0005μg.ml^-1与0．000 002μl.ml^-1，MBC为0．1μg.ml^-1与0．0004μl.ml^-1；对表皮葡萄球菌的MIC为0．0005μg.ml^-1与0．000 002μl.ml^-1，MBC为0．05μg.ml^-1与0．0002μl.ml^-1；对淋病奈瑟菌的MIC为0．001μg.ml^-1与0．000004μl.ml^-1，MBC为0.5μg.ml^-1与0.002μl.ml^-1。结论：川参通注射液能够与头孢唑林钠注射液配伍使用，配伍后对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和淋病奈瑟菌的抑菌及杀菌活性均明显增高。     

沙门菌CWDMs细胞结构的研究

目的 了解沙门菌ＣＷＤＭｓ的形态、细胞超微结构以及细胞壁和胞浆膜的化学结构,探讨沙门菌ＣＷＤＭｓ变异的性质及其机制。方法 采用电子显微镜观察及抗生素、溶菌酶、毛垢黄皂苷敏感试验等方法。结果 伤寒杆菌和甲型事伤寒杆菌的ＣＷＤＭｓ均为产生红色色素、直径０．６～１．２μｍ的感试验等方法。结果 伤寒杆菌和甲型副伤寒杆菌的ＣＷＤＭｓ均为科生红色色素、直径０．６～１．２ｕｍ的革兰氏阴性圆球形态,单个或２～４个     

香茅醇微乳凝胶的制备及体外抗菌试验

目的:优选香茅醇微乳凝胶的处方及制备方法并对其进行体外抗菌试验研究。方法:以微乳区域面积百分比为指标,使用伪三元相图法优化香茅醇微乳的处方;以微乳凝胶的外观、黏稠度、延展性、油腻性为指标,通过单因素试验及正交试验优化香茅醇微乳凝胶的处方工艺。采用试管二倍稀释法考察香茅醇微乳凝胶对金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),通过时间-杀菌效率试验考察香茅醇微乳凝胶及香茅醇微乳的杀菌效率。结果:香茅醇微乳凝胶的最佳处方是15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯-乙醇-香茅醇-卡波姆-980-甘油-水(0.518∶1.037∶0.667∶0.8∶5∶91.978)。香茅醇微乳为淡蓝色透明均一液体,平均粒径54.9 nm,Zeta电位~(-1)0.22 m V。香茅醇微乳凝胶对金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的MIC和MBC均为1.667 g·L~(-1);时间-杀菌效率试验结果表明香茅醇微乳凝胶及香茅醇微乳在2 h对受试菌种的杀菌率达100%。结论:优选的香茅醇微乳凝胶处方工艺稳定可行,该制剂对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有杀伤作用,且起效快。