人单核巨噬细胞泡沫化抑制剂筛选模型的建立及应用

目的: 建立人单核巨噬细胞泡沫化抑制剂筛选模型,筛选得到可抑制细胞泡沫化的抑制剂.方法: U937单核细胞经100 nmol·L-1佛波酯(PMA)诱导72 h分化为巨噬细胞后,换无血清培养液于96孔板中,每毫升含巨噬细胞1×106个,每孔再加入80 mg·L-1氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL),37 ℃培养48 h,建立单核巨噬细胞泡沫化模型.利用微生物发酵液,或单一的化合物样品与其共孵育,油红.染色后观察细胞胞内变化,寻找对泡沫细胞形成有抑制作用的样品.利用基因工程技术表达的人清道夫受体A类II型的胞外部分,在本模型中可抑制巨噬细胞泡沫化的形成,进一步验证了模型的可行性.结果: 从2000 个微生物发酵液中筛选到6株微生物发酵液为阳性,从10个化合物中发现一个有抑制巨噬细胞泡沫化活性的新化合物.结论: 本模型可用于细胞泡沫化抑制剂的高通量筛选.     

以FOXP3为靶点的免疫抑制剂药物筛选模型的建立

目的构建以FOXP3为靶点的免疫抑制剂筛选模型,用于筛选免疫抑制剂。方法以人类基因组DNA为模板,通过PCR扩增人类FOXP3基因启动子,将扩增的启动子DNA片段克隆至pGeneBLAzer-TOPO载体,以PCR方法确定插入片段方向,选取有正向片段的质粒克隆进行测序鉴定,用Lipofectine2000转染Jurkat细胞株,经G418抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过PCR扩增鉴定阳性细胞克隆基因组中整合有FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体。以阳性对照前列腺素-2（PGE2）和PMA/Ionophore刺激细胞,探讨FOXP3启动子对下游报告子β-内酰胺酶活性的影响,并筛选了研究所内约2500余种天然产物。结果通过PCR成功扩增人类FOXP3基因启动子全长区域,构建了FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体,以PCR方法鉴定稳定转染细胞株Jurkat细胞基因组中整合有FOXP3启动子/pGeneBLAzer-TOPO载体,探讨了阳性对照PGE2和PMA/Ionophore对FOXP3基因启动子活性的影响,建立了以FOXP3为靶点的免疫抑制剂药物筛选模型,筛选了研究所2500余种天然产物,获得4个对FOXP3基因启动子具有上调作用的天然产物。结论建立了以FOXP3为靶点的免疫抑制剂筛选模型。     

吴茱萸次碱抗骨质疏松作用研究

骨保护素(osteoprotegerin,OPG)是骨转换的标志物,由成骨细胞等分泌。OPG与核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)结合发挥抑制破骨细胞作用。本研究发现吴茱萸次碱(rutaecarpine,RUT)具有上调OPG表达的活性,并能显著增加小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1及人骨肉瘤细胞U-2OS中OPG的蛋白水平。钙化结节染色实验结果表明,RUT显著促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化;抗酒石酸磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色结果表明,RUT显著抑制RANKL诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7向破骨分化。体内研究发现,与卵巢去势(ovariectomized,OVX)大鼠模型组相比,RUT低剂量组(5 mg·kg^-1·day^-1)和高剂量组(45 mg·kg^-1·day^-1)灌胃给药3个月,显著增加OVX大鼠骨密度;钙黄绿素双标实验及甲苯胺蓝染色实验结果表明,RUT低剂量组在体内促进骨形成并减少骨量丢失;免疫组化结果显示RUT低剂量组能够增加大鼠股骨中OPG的表达。动物福利和实验过程均遵循中国医学科学院医药生物技术研究所动物伦理委员会的规定。综上,本研究表明RUT能上调OPG表达并在体内外促进成骨分化和抑制破骨分化。     

链霉菌CPCC 202950大米发酵中1个新的苯甲酰胺类化合物

采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、闪式反相C_(18)柱色谱以及反相HPLC等多种色谱技术和方法,从链霉菌CPCC 202950大米发酵产物中分离得到8个化合物,借助理化性质和波谱学数据分析,鉴定其结构为3-[(3'-氨基-3'-氧丙-1'-烯-2'-基)氧]苯甲酰胺(1),间位-羟基苯甲酰胺(2),leptosphaepin(3),5-methyluracil(4),feruloylamide(5),对羟基苯乙酰胺(6),vanillamide(7),环-(L-缬氨酸-L-丙氨酸)(8)。其中化合物1为1个新的苯甲酰胺类化合物,2为新的天然产物。化合物1~8对HIV-1蛋白酶均没有明显的抑制作用,对Hela,HepG2和U2OS 3株肿瘤细胞株也未显示出明显的毒性(IC_(50)10μmol·L~(-1))。     

脱氧新羟曲霉酸的分离纯化和结构鉴定

目的研究曲霉菌2101发酵液中上调高密度脂蛋白受体表达的活性成分。方法利用大孔吸附树脂对发酵液中活性成分进行吸附和分步洗脱,用制备高效液相色谱进行精制,紫外、红外、高分辨质谱和核磁共振进行波谱分析。结果分离得到一个纯化合物2101C。结论经波谱分析,2101C为一新结构的化合物脱氧新羟曲霉酸。     

链霉菌CPCC203909发酵物中1个新的曲古柳菌素

应用已建立的CLA-1表达上调剂的高通量筛选模型,得到一株阳性链霉菌株CPCC 203909,并采用硅胶柱色谱、闪式反相C₁₈柱色谱以及反相HPLC等色谱技术和方法,从链霉菌CPCC 203909的大米发酵提取物中分离得到1个新化合物,借助理化性质和波谱学数据分析,以及CD光谱比较和Marfeys法确定了其结构,鉴定为(-)-(R,2E,4Z)-7-[4'-(二甲基氨)苯基]-4,6-二甲基-7-氧代庚-2,4-二烯酰基-L-谷氨酰胺(1).体外活性测试表明,化合物1对人胚肾293细胞具有一定的细胞毒作用,IC₅₀为35.3 μmol·L^-1.     

链霉菌CPCC 202950的化学成分研究

采用大孔树脂、MCI树脂、闪式反相C₁₈柱色谱以及反相HPLC等多种色谱技术和方法,从链霉菌CPCC 202950的发酵液中分离得到11个化合物,借助理化性质和波谱学数据分析,鉴定其结构为1H-pyrrole-2-carboxamide(1), 5'-deoxy-5'-methylthioinosine(2), vanillamide(3), trans-3-methylthioacrylamide(4), 1,2,3,4-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole-3-carboxylic acid(5), 环(L-脯氨酸-L-酪氨酸)(6), N-[2-(4-hydroxyphenyl)]ethylacetamide(7), 苯甲酰胺(8), cyclo(L-leucyl-trans-4-hydroxy-L-proline)(9), 环(苯丙氨酸-甘氨酸)(10), 色氨酸(11)。其中化合物1和2为新的天然产物;化合物 1~11 对HIV-1蛋白酶均没有明显的抑制作用(IC₅₀ > 10 μmol·L^-1)。     

人高密度脂蛋白受体CLA-1上调剂9179D的分离、结构鉴定和活性研究

目的从微生物代谢产物中分离能够上调人高密度脂蛋白受体（CLA-1）表达的新型活性化合物,并对其活性进行研究。方法应用已建立的CLA-1表达上调剂的模型,对阳性菌株链霉菌104A-9179发酵产物的活性成分进行分离纯化,获得活性化合物9179D;通过理化性质、质谱、紫外和核磁等波谱学数据进行结构鉴定;利用RT-PCR和Western Blot方法检测9179D对HepG2中CLA-1表达的影响;利用流式细胞仪检测其对小鼠巨噬细胞RAW264.7结合DiI-HDL的影响。结果从链霉菌104A-9179发酵产物中得到活性化合物9179D,并确定了其结构为曲占柳菌素D（Trichostatin D）;9179D在CLA-1上调剂模型上的EC₅₀为46.02μmol/L,表达活性最高值为934%;9179D能增加HepG2中CLA-1的mRNA和蛋白表达;增加RAW264.7对DiI-HDL的结合。结论得到一个微生物来源的具有强的上调CLA-1的表达活性的化合物-9179D（曲古柳菌素D）,属首次报道。