小干扰RNA沉默 HIF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2 表达的影响

目的：以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤(human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。

方法：将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组; 对正常组细胞用含有浓度为10%的胎牛血清和1%的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/L CoCl₂以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1α siRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA的表达,行Western-blot检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。

结果：与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA表达量无明显变化(P>0.05); MMP-2 mRNA及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.05),证实转染成功; 干扰组HIF-1αmRNA和MMP-2 mRNA和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。

结论：缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。     

小干扰RNA沉默 HlF-1α对缺氧状态下脉络膜黑色素瘤细胞中MMP-2表达的影响

目的：：以小干扰RNA沉默人眼脉络膜黑色素瘤细胞中的低氧诱导因子-1( hypoxia inducible factor-1, HIF-1)基因,在缺氧状态下观察其对人眼脉络膜黑色素瘤( human uveal melanoma cell,OCM-1)细胞中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)基因表达的影响。方法：将脉络膜黑色素瘤细胞分为正常组与缺氧组,其中将缺氧组再分成单纯缺氧组、干扰组、脂质体对照组、阳性对照组和阴性对照组;对正常组细胞用含有浓度为10％的胎牛血清和1％的双抗(青-链霉素混合液)的DMEM 高糖培养基进行培养。在缺氧组人眼OCM-1细胞的培养瓶中加入100μmol/ L CoCl2以构建肿瘤细胞内部的缺氧微环境。干扰组转染HIF-1α siRNA,阴性对照组转染无义siRNA,阳性对照组转染β-actin siRNA,脂质体对照组转染空脂质体。RT-PCR 检测细胞中HIF-1α和MMP-2 mRNA 的表达,行Western-blot 检测HIF-1α和MMP-2蛋白的表达。结果：与正常组相比,单纯缺氧组HIF-1α蛋白的表达增高(P<0.05),而其mRNA 表达量无明显变化(P>0.05); MMP-2 mRNA 及蛋白的表达升高(P<0.05)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA 表达下降(P <0.05),证实转染成功;干扰组HIF-1αmRNA 和MMP-2 mRNA 和蛋白表达均下降(P<0.05),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。结论：缺氧条件下可以提高人眼脉络膜黑色素瘤细胞中 HIF-1α蛋白的表达,而且HIF-1α蛋白的表达水平可以影响MMP-2的转录与翻译,从而可能进一步影响人眼脉络膜瘤细胞的外周浸润和远处转移能力。     

siRNA特异性沉默HIF-1α对缺氧培养的OCM-1细胞中Vimentin表达的影响

目的：研究小干扰RNA(siRNA)特异性沉默缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对缺氧状态下人眼葡萄膜黑色瘤OCM-1细胞中波形蛋白(Vimentin)表达的影响,初步探讨HIF-1α对葡萄膜黑色瘤上皮-间质转化(EMT)的调控作用。

方法：体外常氧培养及缺氧培养OCM-1细胞。其中,缺氧培养是通过在培养基中加入浓度为100μmol/L的氯化钴(CoCl₂)模拟肿瘤内部缺氧微环境,并将缺氧培养细胞分为单纯缺氧组、HIF-1α干扰组、β-actin阳性对照组、无义寡核苷酸阴性对照组及空载脂质体对照组。体外设计合成siRNA(包括HIF-1α-siRNA、β-actin-siRNA及阴性对照),以Lipofectamine^TM 2000为载体介导siRNA转染缺氧培养的OCM-1细胞,以RT-PCR和Western blot检测缺氧培养前后及转染前后HIF-1α、Vimentin基因和蛋白的表达。

结果：单纯缺氧组与常氧组相比,HIF-1αmRNA表达无明显差异(P>0.05),蛋白表达显著升高(P<0.01),而Vimentin mRNA和蛋白的表达均显著升高(P<0.01)。缺氧培养的各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(P<0.01),证实转染成功; 干扰组HIF-1α、Vimentin mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.01),阴性对照组、脂质体对照组各检测因素均无明显差别(P>0.05)。

结论：缺氧可促使OCM-1细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高,并可通过转录激活下游靶基因Vimentin,使其在mRNA和蛋白水平表达均升高,提示HIF-1α可能参与调控葡萄膜黑色瘤的EMT,进而促进肿瘤侵袭、转移; HIF-1α-siRNA转染OCM-1细胞可成功下调HIF-1α及Vimentin的表达,说明从分子水平抑制HIF-1α的表达,可能抑制肿瘤侵袭、转移,从而为肿瘤治疗提供新方向。