基于上转化发光免疫层析技术建立发热伴血小板减少综合征病毒总抗体快速检测方法

目的基于上转化发光(UPT)免疫层析技术,建立发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)总抗体的现场快速检测方法。方法将SFTSV重组NP蛋白与上转化发光颗粒(UCP)偶联,制备UCP-NP免疫层析试纸条,评价该试纸条检测SFTSV总抗体的灵敏性、特异性和稳定性,并检测SFTSV血清254份,与酶联免疫法(ELISA)比较。结果该方法可在15min内完成SFTSV总抗体检测,可检测1∶500稀释度的SFTSV阳性血清,与其他出血热病毒无交叉反应,加样14d内稳定性较高。UPT免疫层析法与ELISA法检测临床血清样品一致性极高(Kappa=0.967),约登指数为0.973。结论建立了基于UPT免疫层析技术的SFTSV总抗体快速检测方法,该方法灵敏、特异,且操作简便、快速,结果稳定,适合在基层门诊和体检现场推广。     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs的原核表达及初步鉴定

目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。     

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)人源性单链抗体文库的构建

目的构建人源性严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)单链抗体(scFv)文库,并用SFTSV颗粒对文库进行初步筛选。方法提取8例SFTS恢复期患者外周血淋巴细胞的总RNA,逆转录为cDNA;并以此为模板PCR扩增人源抗体轻链库(Vκ和Vλ)和重链库(VH),再经过重叠PCR随机拼接成scFv基因文库,最后克隆入噬菌粒载体pComb3XSS中,将重组噬菌粒电转化感受态XL1-Blue细胞,得到SFTSV抗体文库,检测文库库容及多样性,并用SFTSV颗粒作抗原对抗体文库进行初步筛选。结果构建的人源SFTSV抗体文库的库容为2.8×10~7,测序结果表明文库多样性好,经过初步筛选获得21个克隆的人源化scFv,具有与SFTSV颗粒结合的活性。结论成功构建了人源抗SFTSV的scFv文库。     

含H5N1禽流感病毒核酸序列的病毒样颗粒的制备及应用

目的构建耐RNase酶的内含禽流感病毒H5N1亚型部分核酸序列的病毒样颗粒。方法构建中间载体pET32a-MS2,将禽流感病毒H5N1亚型的HA、NA和M基因片断连接到中间载体上,构建原核表达载体pET32a-MS2-HA,pET32a-MS2-NA和pET32a-MS2-M,分别转化宿主菌,诱导表达制备病毒样颗粒。结果表达载体经PCR、酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。电镜观察到了病毒样颗粒,荧光定量RT-PCR试验表明颗粒稳定性良好。结论成功构建了含禽流感病毒H5N1部分核酸序列的病毒样颗粒且稳定性良好,可作为禽流感H5N1亚型RNA检测的标准品和质控品。     

江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒血清流行病学调查

目的 调查江苏省人与动物发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)血清流行病学情况,为控制疫情提供流行病学线索。 方法 2010年7-11月在江苏省南京江宁区、溧水县,常州溧阳市,无锡宜兴市,淮安盱眙县和连云港东海县共采集2853份血清,其中人血清1922份、动物(犬、羊、猪、牛、鹅、鼠和鸡)血清931份, 运用双抗原夹心ELISA法检测血清中SFTSV总抗体,并进行不同地区SFTSV总抗体阳性率比较。 结果 本次调查2853份血清样本中SFTSV总抗体阳性血清121份,阳性率为4.24%,提示江苏省存在SFTSV的流行。在7种被调查的动物样本中,5种动物(犬、羊、牛、猪、鸡)血清样本SFTSV总抗体阳性,阳性率分别为6.40%、57.14%、31.82%、5.33%和0.98%;人血清中SFTSV总抗体阳性率为0.94%。血清中SFTSV总抗体阳性率存在地区差异。人群与动物SFTSV血清总抗体阳性率存在正相关关系。 结论 江苏省是SFTSV的流行区域,需加强SFTSV的预防意识及诊断能力。     

抗严重发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白单链抗体的筛选和鉴定

目的筛选及表达抗严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)包膜糖蛋白(Gn)单链抗体(scFv)。方法利用人源化SFTSV的scFv文库与固相化包被的SFTSV-Gn蛋白特异性结合,经过4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选能特异性结合SFTSV-Gn蛋白的噬菌体scFv,随机挑取最后一轮单菌落进行噬菌体-ELISA鉴定,将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中原核表达,用Western blot法鉴定scFv的表达, ELISA鉴定纯化后scFv的结合活性。结果筛选出3株不同序列的抗SFTSV-Gn蛋白的scFv, Western blot法结果显示scFv得到正确表达, ELISA结果显示纯化后的scFv具有结合活性。结论成功筛选及表达了抗SFTSV-Gn蛋白的scFv。     

甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

[目的]构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体,并在293T细胞中表达.[方法]采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒H1N1毒株提取的病毒总RNA中,扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达.[结果]酶切、测序证明重组真核表达载体PXJ40-HA-NS1构建成功,免疫印迹法可见NS1基因编码蛋白表达.[结论]成功构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体PXJ40-HA-NS1,并在293T细胞中传染表达,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料.     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

含肠道病毒5'端非编码区部分核糖核酸序列病毒样颗粒的构建

目的 构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒.方法 利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV.将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验.结果 表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.RT-PCR和稳定性实验结果 表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好.结论 成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用.     

发热伴血小板减少综合征血清学监测

目的调查发热伴血小板减少综合征(SFTS)病毒在人群及动物中的隐性感染情况,为制定防治对策提供依据。方法在东海县SFTS发病地区与非发病区采集不同年龄健康人群及牛、鸡、猪、犬、羊等动物血,用双抗原夹心ELISA法检测血清中STFSV总抗体。结果人群血清中未检测到SFTSV抗体,在发病区与非发病区的牛、鸡血清中检测到SFTSV抗体。结论与人密切接触的牛、鸡能够感染SFTSV并可能携带病毒,要加强对牛、鸡的SFTSV疫情监测。