钙离子水平对猪卵母细胞体外成熟与早期胚胎发育的影响

维持细胞内钙离子(Ca²⁺)稳态对维护卵母细胞成熟及植入前胚胎正常发育至关重要。本实验旨在研究Ca²⁺水平变化对猪卵母细胞体外成熟发育的影响。收集的猪卵丘卵母细胞复合体(COCs)，随机分为3组，即对照组、100 nmol/L毒胡萝卜素(TG)组和100 nmol/L TG+300 nmol/L光溜海绵素C(XeC)组，体外培养，分别统计卵丘扩散情况、体外成熟率、胞内Ca²⁺水平，随后进行孤雌激活(PA)统计各组卵裂率、囊胚率及细胞总数。结果表明：添加XeC可显著改善由TG引起的猪卵丘细胞扩散不完全，卵母细胞体外成熟率、卵裂率和囊胚率降低，以及细胞数减少等现象，并显著降低由TG诱导的胞内Ca²⁺水平。综上，胞内Ca²⁺水平对猪卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育具有重要的调控作用。     

生产转基因五指山小型猪重构胚条件优化

利用体细胞核移植技术是得到具有优良特征及抗病性五指山小型猪快速有效方法,因此将外源基因安全高效导入到供核细胞至关重要。利用不同转染试剂、转染方法对转染效率进行研究,确定G418筛选浓度。同时利用体细胞核移植技术生产转单体红色荧光蛋白重构胚。结果表明,使用U-023细胞核电转程序能有效介导质粒pCX-mRFP1转染猪耳成纤维细胞,转染率可达到83.33%。确定G418最佳筛选浓度为200μg.mL-1。利用转基因细胞作为核供体生产重构胚卵裂率是83.08%(221/266),囊胚率是11.65%(31/266)。研究结果为生产表达单体红色荧光蛋白五指山小型猪提供参考,从而为人类疾病发病机理研究以及生产人类疾病模型动物奠定了基础。     

甘氨酸对猪卵母细胞体外成熟质量及卵丘细胞的影响

本实验旨在研究甘氨酸对卵丘细胞及卵母细胞体外成熟质量的影响,优化猪卵母细胞体外成熟(IVM)培养体系。在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加6 mmol/L甘氨酸,体外培养至44 h后,通过倒置显微镜测量卵丘细胞扩散直径,结合流式细胞术与qPCR检测卵丘细胞凋亡情况;进一步检测成熟卵母细胞中谷胱甘肽(GSH)、细胞成熟促进因子(MPF)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)水平及细胞成熟相关基因表达。结果表明:甘氨酸能显著提高卵丘细胞扩散直径,减少卵丘细胞的总凋亡率,并能显著提高卵丘细胞中Bcl-2的mRNA表达;甘氨酸能显著增加成熟卵母细胞中的GSH、MPF和MAPK水平以及成熟相关基因BMP15、GDF9、CyclinB1、CDK1、C-MOS的mRNA表达。综上可知,甘氨酸可提高猪卵母细胞体外成熟质量,降低卵丘细胞凋亡率。     

VE对犬卵母细胞体外成熟的影响

在基础培养液中分别添加浓度为0,50,100,200μmol/L的VE,研究不同浓度VE对成熟情况的影响。结果表明,体外培养48h后VE浓度为50μmol/L组GV期的比率显著高于100和200μmol/L组(P<0.05);100μmol/L组GVBD期的比率显著低于其它组(P<0.05);达到MI-MII期的比率各组之间差异不显著(P>0.05),但100μmol/L组MI-MII期的比率相对较高。体外培养72h后,VE浓度为200μmol/L组的GV期的比率显著高于对照组和100μmol/L组(P<0.05),与50μmol/L组之间差异不显著(P>0.05);达到GVBD和MI-MII期的比率各组之间均差异不显著(P>0.05)。因此,VE对犬卵母细胞的核成熟没有明显促进作用。     

SETD2在猪卵母细胞体外成熟中的作用

SETD2是H3K36me3特异性甲基转移酶，参与组蛋白甲基化修饰，并通过调节多种基因的表达影响细胞功能。为探究SETD2在猪卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）过程中的表达规律及作用，通过免疫荧光染色检测SETD2及H3K36me3在猪卵母细胞IVM过程中各个时期（GV、MⅠ、MⅡ期）的表达定位情况；在GV期显微注射SETD2干扰RNA(SETD2-siRNA)构建干扰模型，检测干扰后对SETD2、H3K36me3、DNA双链断裂标志物（γH2AX）以及第一极体（PBI）排出率的影响；通过qPCR技术检测干扰后对DNA甲基化转移酶DNMT3B、凋亡和抗凋亡相关基因BAX、BCL2表达的影响。结果表明：SETD2信号GV期聚集在DNA周围，MⅠ和MⅡ期均在细胞质中表达，而H3K36me3在整个减数分裂过程中均与核共定位；进一步研究发现，SETD2-siRNA干扰后显著降低了SETD2和H3K36me3表达水平，增加了γH2AX表达（P<0.05），同时显著降低PBI排出率（P<0.05）;qPCR结果显示，SETD2-siRNA干扰后DNMT3...