家蚕微孢子虫6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Nb6PGDH的克隆及表达特征分析

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)是戊糖磷酸途径的限速酶,参与生物体内递氢体NADPH的产生。通过检索微孢子虫数据库获得家蚕微孢子虫6PGDH基因序列,以家蚕微孢子虫镇江株基因组为模板,设计特异性引物成功克隆了该基因,命名为Nb6PGDH,并对该基因进行序列特征和表达特征分析,为了解6PGDH基因在微孢子虫生长发育过程中的功能提供有用信息。克隆得到的序列全长1 374 bp,包含一个完整的ORF,编码457个氨基酸;与Gen Bank数据库中家蚕微孢子虫6PGDH基因长度相同,相似度为99. 42%,其中8个碱基存在差异,编码的3个氨基酸发生改变。生物信息学分析表明Nb6PGDH蛋白没有信号肽,无跨膜结构域,分子质量为51. 8 k D,等电点5. 83,存在38个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR分析结果表明,家蚕微孢子虫感染家蚕后2~168 h,中肠组织中Nb6PGDH基因都有所表达,且表达水平在生长发育过程中发生变化,说明Nb6PGDH基因在家蚕微孢子虫增殖发育过程中具有一定的生理功能。     

家蚕微孢子虫丙酮酸激酶基因的克隆与表达特征分析

丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)在糖酵解最后一步起着不可逆的作用,可以催化磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基团转移给ADP生成ATP和丙酮酸。通过在NCBI和家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)数据库中对丙酮酸激酶基因的比对分析,选择家蚕微孢子虫丙酮酸激酶M2亚型的一个基因(NbPK-2,GenBank登录号EOB11679.1)进行克隆。生物信息学分析显示,该基因序列长度为1 359 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码452个氨基酸,预测蛋白质等电点为7.13,相对分子质量为51.7 kD,没有信号肽;NbPK-2蛋白的二级结构预测显示其含有38%的螺旋、21%的延伸片段和40%无规则卷曲。通过qRT-PCR检测感染微孢子虫后家蚕不同发育时期的NbPK-2表达水平,发现该基因在感染后24 h内处于相对较高的表达水平,而此后表达水平开始降低,至144 h达到最低值,在168 h又有所升高。研究结果可促进对家蚕微孢子虫糖酵解途径的研究,为家蚕微粒子病的防控奠定理论基础。     

家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCTθ的鉴定

家蚕微粒子病是一种严重危害蚕种生产的蚕病,被列为蚕桑生产唯一的检疫对象.分子伴侣协助底物蛋白折叠、装配和转运,但目前对家蚕微孢子虫分子伴侣CCT(chaperonin containing tailless complex polypeptide)的研究较少.本研究克隆了家蚕微孢子虫NbCCTθ基因,构建原核表达载体pET-28a-NbCCTθ表达重组蛋白,纯化后制备多克隆抗体.间接免疫荧光分析结果显示,NbCCTθ在家蚕微孢子虫的整个生命周期中均表达,但在不同发育阶段分布不同;在成熟孢子中主要分布于细胞质和质膜上,在裂殖增殖期主要分布于细胞质中,孢子形成期后期定位在细胞核中.研究结果为进一步探索NbCCTθ的具体功能奠定了基础,对家蚕微粒子病的防治也有一定的指导意义.     

纳米金比色法在家蚕微孢子虫检测中的应用

家蚕微粒子病被列为蚕种生产的唯一检疫对象,母蛾镜检家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,简称Nb)是目前最主要的检疫手段,但其准确性受到多种因素影响。建立一种简便、快捷、准确的Nb检测技术,对家蚕微粒子病的防治具有重要意义。基于纳米金(AuNPs)比色法原理,对AuNPs探针的制备及其标记的最佳抗体浓度和最佳pH值进行探究,以及探究AuNPs比色法检测Nb的灵敏度。结果表明,Nb抗体与AuNPs(20 nm)结合最佳浓度为每500μL AuNPs溶液中添加5μL 0.5 mg/mL抗体蛋白,标记最佳pH值为8.5。AuNPs比色法能够最低检测出Nb蛋白量为10 ng。本研究成功建立一种基于AuNPs比色法检测Nb的新方法。     

家蚕微孢子虫核糖-5-磷酸异构酶A基因的克隆及表达特征分析

核糖-5-磷酸异构酶A(ribose 5-phosphate isomerase A,RpiA)是多种生物中普遍存在的一种高度保守的蛋白酶,在磷酸戊糖途径(PPP)中起着核心作用,参与原核生物与真核生物核糖-5-磷酸(R5P)与核酮糖-5-磷酸(Ru5P)之间的可逆异构化反应及植物二氧化碳固定的卡尔文循环。为探索RpiA在家蚕微孢子虫侵染家蚕后能量代谢与物质合成过程中所发挥的作用,通过PCR扩增得到NbRpiA基因的编码区。该开放阅读框全长345 bp,编码114个氨基酸,预测蛋白质的分子质量约为13.145 kD,等电点为7.72,未发现明显已知功能结构域。实时荧光定量PCR检测发现,NbRpiA基因在家蚕微孢子虫感染家蚕后7 d内均有表达:从感染后2 h起,NbRpiA基因的表达水平呈缓慢上升的趋势,第2天达到最高,随后表达水平逐渐降低,从第4天开始表达水平大幅降低,至第7天降至最低。初步推测NbRpiA可能在家蚕微孢子虫孢子发芽及增殖阶段发挥作用。研究结果为了解NbRpiA在家蚕微孢子虫能量代谢与物质合成中的作用提供了初步线索。     

BmCPV多角体蛋白对异源蛋白的包埋

为了解家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体蛋白对异源蛋白的包埋作用,将BmCPV的多角体蛋白基因克隆至昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,转染家蚕卵巢培养细胞(BmN)后通过吉欧霉素(zeocin)筛选获得稳定表达多角体蛋白的细胞株。倒置荧光显微镜观察发现,转化BmN细胞有轻度的病理变化,细胞质中有呈绿色荧光的多角体蛋白结晶,但从转化BmN细胞中纯化的多角体无明显的绿色荧光。以修饰型线性化家蚕杆状病毒BmPAK6感染稳定转化BmN细胞,96 h后纯化多角体,回复感染显示多角体裂解液能感染家蚕BmN细胞,表明BmCPV多角体蛋白能包埋BmPAK6。纯化的多角体及多角体裂解液均能用X-gal显色,表明BmPAK6表达的β-半乳糖苷酶也能被BmCPV的多角体蛋白包埋。研究结果可为获得具有多角体的重组杆状病毒以及开发利用质型多角体蛋白包埋异源蛋白的功能提供新的技术途径。     

家蚕微孢子虫伴侣蛋白CCT-α亚基的鉴定和亚细胞定位

CCT(chaperonin containing T-complex polypeptide 1,或称TRiC)是一种广泛存在于真核细胞中的伴侣蛋白,主要参与真核细胞中细胞骨架蛋白β-tubulin和actin的折叠和组装.CCT-α亚基作为单体或复合体在细胞骨架蛋白的折叠和组装中起着关键作用.对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的CCT-α基因(NbCCT-α)进行鉴定和表达分析,该基因包含一个全长1 629 bp的完整ORF,编码由542个氨基酸组成的蛋白质.NbCCT-α的分子质量为59.662 kD,等电点(pI)为5.81,无信号肽和跨膜结构域.亚细胞定位结果表明,NbCCT-α 蛋白位于休眠孢子的细胞质和质膜上,并在孢子萌发结束后转移到胞原质表面.在微孢子虫增殖时期,NbCCT-α蛋白不仅存在于细胞质中,还存在于核周和细胞膜.此外,NbCCT-α基因转录水平从感染后24 h开始升高,感染后96 h时达到最高,暗示CCT-α可能在家蚕微孢子虫的增殖中发挥作用.该研究为进一步探索Nb-CCT-α蛋白的功能奠定了基础.     

家蚕微孢子虫己糖激酶基因的克隆及序列结构分析和原核表达

己糖激酶(hexokinase,HXK)是糖酵解途径的限速酶,在能量代谢中充当极其重要的角色。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)具有完整的糖酵解途径,其基因组中有2个序列相似度较高的己糖激酶编码基因拷贝(NBO_1320g0001,NBO_27g0008)。根据其中的一个基因拷贝(NBO_27g0008)序列设计特异性引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板成功克隆了该基因,命名为Nb HXK-1。该基因大小为894 bp,包含完整的ORF,编码297个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为34.241 k D,等电点(p I)为5.26,蛋白质的氨基酸序列有31个磷酸化位点和4个潜在的N-糖基化位点,无跨膜结构域,有信号肽,二级结构主要由α螺旋(54.55%)、延伸片段(17.80%)和无规则卷曲(27.61%)组成。系统进化分析显示Nb HXK-1与东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)己糖激酶(Nc HXK)氨基酸序列的亲缘关系较近。将Nb HXK-1基因插入原核表达载体p ET-28a(+)并转化BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达后经蛋白质串联质谱鉴定和Western blot分析显示,获得了与预期大小一致的约35 k D的重组Nb HXK-1蛋白,为进一步阐明Nb HXK-1的生物学功能奠定了基础。