农杆菌介导的柳枝稷遗传转化体系的优化

【目的】为建立农杆菌介导的柳枝稷高效再生及遗传转化体系。【方法】试验以柳枝稷品种Alamo、Performer及Blackwell的成熟种子为外植体诱导愈伤组织。愈伤诱导6周后,借助解剖镜观察愈伤形态,去除愈伤组织外层含水量大、海绵状愈伤组织,挑选位于愈伤组织中心位置的核状、紧实型愈伤置于继代培养基培养。暗培养3周后,在解剖镜下挑选结构松脆、生长旺盛的愈伤组织按细胞系继代增殖培养。该类愈伤组织易于分化,属单子叶植物愈伤组织分类中的第Ⅱ型。经两次继代增殖培养后,可以获得足够的愈伤组织进行再生和遗传转化研究。为优化柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的农杆菌侵染流程,试验比较了3种农杆菌侵染流程下的转基因效率。真空和干燥处理（VD）：将装有愈伤组织及菌液的50 mL离心管置于真空泵中抽真空10 min（压力-0.8MPa）,28℃, 80 r/min慢摇20 min后弃菌液,将愈伤组织堆放于3层滤纸上干燥处理2 h,随后将愈伤组织转入含有500 μL无菌水的2层滤纸上进行共培养;冷处理加真空和干燥处理（CVD）：侵染前将愈伤组织置于3%麦芽糖、300 μmol·L^-1谷氨酰胺（Gln）溶液中冰浴20 min,然后依VD流程侵染,共培养阶段用MP培养基代替无菌水;渗透冷处理加真空和干燥处理（PVD）：用6%的麦芽糖溶液替代CVD中3%麦芽糖溶液。通过比较Gus染色及PCR阳性率来评价三种方法的转化效率。【结果】愈伤挑选方法不仅从柳枝稷低地型品种中挑选得到再生率达95%以上的Ⅱ型愈伤细胞系,也首次获得高地型品种Blackwell的Ⅱ型愈伤组织,分化率达50%。不同转化方法评价过程中发现,低地型品种AlamoⅡ型愈伤组织采用CVD农杆菌侵染流程转化效率最高,达72%,显著高于侵染流程VD（53%）和PVD（44%）。应用CVD转化法,Performer转化率达96%;首次成功进行了高地型品种Blackwell的遗传转化,转化效率为5.6%。【结论】本研究建立了借助解剖镜挑选柳枝稷易于再生的Ⅱ型愈伤组织的方法,该方法适用于柳枝稷不同生态型品种;农杆菌转化过程中采用CVD侵染流程可显著提高转基因效率。本研究首次报道了柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的挑选流程,建立了适合不同生态型柳枝稷的高效再生及遗传转化体系,首次获得高地型品种Blackwell的转基因植株,为柳枝稷遗传改良及其功能基因研究奠定基础。该方法也适用与其他难于再生的单子叶植物再生及遗传转化体系的建立。     

miR396-MsGRFs参与调控紫花苜蓿愈伤组织再生

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)愈伤组织再生率受基因型限制,是影响苜蓿遗传转化效率的主要因素之一。研究发现,GRF转录因子家族基因在提高多种植物愈伤再生中起着重要促进作用。本试验以拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGRF序列为模板,在紫花苜蓿基因组序列中查找,获得了含有miR396靶点的9个MsGRFs基因。除MsGRF3a和MsGRF4a外,其余7个MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈伤组织中的表达量均显著高于非胚性愈伤。为了进一步研究MsGRFs对紫花苜蓿愈伤再生效率的影响,我们在紫花苜蓿中转入MIM396基因,降低miR396的表达。结果显示：MIM396植株叶片愈伤组织再生时间显著缩短,再生率显著提高;与野生型愈伤组织相比,在MIM396植株叶片诱导的愈伤组织中,除MsGRF3a外,其余MsGRFs显著高表达。以上研究表明,miR396-MsGRF通路对苜蓿愈伤组织再生起着重要调控作用,这为提高苜蓿再生效率,并打破基因型对不同苜蓿品种再生的限制提供候选基因。     

水淹胁迫对棉花幼根ADHa与BADH表达的影响

 研究了盆栽棉花幼根在不同时间（0 h,12 h,1 d,2 d,4 d和8 d）水淹胁迫环境下乙醇脱氢酶（ADHa）和甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因相对表达量的变化,结果表明：与对照（0 h）组比较,水淹对ADHa表达在各时间段均具有极为显著的刺激作用;BADH表达在12 h、1 d和8 d时,表达变化不显著,2 d和4 d表达受到显著抑制。     

淹涝和低温胁迫对小麦幼根BADH表达的影响

为测定淹涝和低温胁迫下小麦幼根中甜菜碱醛脱氢酶基因BADH表达的变化,将扬麦13种子种植于花盆土壤中,待幼苗生长至1cm左右时,随机分为对照组、淹涝胁迫组和低温胁迫组。对照组和淹涝胁迫组均置于25℃植物培养箱中,其中淹涝胁迫组将花盆置于水中;低温胁迫组置于5℃植物培养箱中。各组均处于光照/黑暗12 h交替,对照组和低温胁迫组每日适量浇水。各组分别在0 h、12 h、1 d、2 d、4 d和8 d时取根,剪取根尖处1 cm组织,提取总RNA,逆转录,荧光定量PCR法测定BADH表达。结果表明,低温对BADH表达的刺激作用主要表现在12 h和1 d,表达量分别是对照的2.9倍和16.0倍;淹涝胁迫组在1 d表达升高,在2 d和4 d表现出显著的抑制作用。小麦BADH表达的变化可能与低温抗逆性有关,而与淹涝抗逆性关联不显著。     

盐胁迫对水稻幼根乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因表达的影响

以水稻(Oryza sativa)南粳44号为材料,研究不同浓度NaCl胁迫对水稻幼根中乙醇脱氢酶(ADH3)和乙醛脱氢酶(ALDH)基因表达的影响.结果表明,NaCl浓度和胁迫时间都对ADH3和ALDH的表达有影响.与对照相比,100 mmol/L NaCl胁迫后ADH3和ALDH的相对表达量下降或没有显著变化;而300、400 mmol/L NaCl胁迫12、192 h时ADH3和ALDH的相对表达量极显著高于对照,胁迫48 h时这两个基因的相对表达量则显著或极显著低于对照.     

低温胁迫下水稻幼根乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因表达变化

为研究低温胁迫下水稻幼根中乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)基因表达变化,选取南粳44号水稻种子,常规促发芽,待幼根发至长1cm时,将其随机分为对照组和试验组,分别置于25℃和5℃环境下,两组均分别在0、6、12、24、48、96 h取根,提取RNA,逆转录,用荧光定量PCR法测定ADH和ALDH基因的表达量。结果显示ADH和ALDH表达量均呈现出先降后升的变化趋势;试验组的表达量均显著高于对照组。结果表明水稻ADH和ALDH在低温胁迫下表达量升高可能与低温抗逆性有关。     

淹涝和低温胁迫对小麦幼根ADH与BADH表达的影响

测定淹涝和低温胁迫下小麦幼根中乙醇脱氢酶(ADH)和甜菜碱醛脱氢酶(BADH)表达变化.扬麦13号种子,种植于花盆土壤中,待幼苗生长至1 cm左右时,随机分为对照组、淹涝胁迫组和低温胁迫组,对照组和淹涝胁迫组均置25℃植物培养箱中,其中淹涝组淹没于水中;低温组置5℃植物培养箱中,光照/黑暗12 h交替,每日适量浇水.各组分别在0h、12 h、1d、2d、4d和8d时取根,剪取根尖处1 cm组织,提取总RNA,逆转录,荧光定量PCR法测定ADH2a和BADH表达.结果显示:低温和淹涝对ADH表达均具有极为显著的刺激作用,且淹涝胁迫的作用又远大于低温胁迫;低温对BADH表达的刺激作用主要表现在1d时,淹涝对BADH表达在2d和4d时表现出较为显著的抑制作用;小麦ADH和BADH在低温和淹涝胁迫下表达变化可能与抗逆性有关.     

淹涝胁迫对幼苗期大豆根系乙醇脱氢酶1基因和乙醛脱氢酶7基因表达的影响

以通豆7号的种子为材料,在常规花盆土壤中种植发芽.待子叶刚破土时,随机分为对照组和试验组,分别置于常规和水淹环境下,分别在0、24、48、72、96h时取根尖组织,并提取RNA用 逆转录、荧光定量PCR法测定ADH1和ALDH7的表达.结果显示:ADH1和ALDH7的表达均呈现先降后升再降的变化趋势；试验组的表达量与对照组的表达量有显著差异.表明大豆的ADH1和ALDH7在淹涝胁迫条件下表达量的明显变化与淹涝抗逆性的影响有密切关系.     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD)基因的耐盐功能，本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列，并以其叶片为试验材料，通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根，验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质，二级结构以无规则卷曲为主，C-端含有RPE65保守结构域；MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件；盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高；盐胁迫生理实验证明，过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。