基于Netrin-1介导神经萌发探讨温经活血外治法对膝骨关节炎大鼠疼痛的影响

目的 研究Netrin-1介导感觉神经萌发对膝骨关节炎(Knee osteoarthritis, KOA)大鼠疼痛行为的影响及温经活血外治法的干预作用。方法 随机将30只大鼠平均分为空白组、KOA组及外治法组。KOA模型通过前交叉韧带横断术构建,造模成功后,外治法组使用温经活血外治法代表方——“易层”贴敷28 d。给药完成后各大鼠腹主动脉采血并提取各组滑膜组织和背根神经节(Dorasal root ganglion, DRG)组织,苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining, HE)染色观察滑膜炎症,神经镀银染色滑膜观察神经萌发;ELISA检测血清中促炎因子白介素-6(Interleukin 6,IL-6)和疼痛介质P物质(Substance p, SP)、降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)含量;Western blot和qPCR检测滑膜组织Netrin-1、CGRP和DRG组织神经元表面受体结直肠癌缺失基因(Deleted in colorectal cancer, DCC)、非协调同源-5(Unco...     

“易层”贴敷对膝骨关节炎大鼠滑膜纤维化的改善作用及机制

目的 探究“易层”贴敷对膝骨关节炎（KOA）大鼠滑膜纤维化（SF）的改善作用及潜在机制。方法 将雄性SD大鼠随机分为假手术组、KOA组和易层组,每组8只。KOA和易层组大鼠以前交叉韧带离断法复制KOA模型。造模14 d后,易层组大鼠于膝关节均匀涂抹“易层”贴敷[三色散（每100 cm2涂抹8 g）和复方三黄油膏（每100 cm2涂抹5 g）],每天贴敷8 h,连续28 d。末次给药后,观察各组大鼠的滑膜炎症程度及纤维化程度并进行Krenn评分,检测其滑膜组织中Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ）、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、磷酸化核因子κB p65(p-NF-κB p65)蛋白的表达,血清中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量,以及滑膜组织中纤维化及HMGB1/Toll样受体4(TLR4)/NF-κB通路相关蛋白及mRNA的表达。结果 与假手术组比较,KOA组大鼠滑膜衬里细胞大量增生且排列紊乱,炎症细胞浸润和胶原纤维沉积明显;collagenⅠ、HMGB1、p-NF-κB p65阳性表达细胞均明显增加,血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量...     

膝痹宁Ⅱ联合脂肪干细胞外泌体调控线粒体自噬改善膝骨关节炎的机制

目的 观察膝痹宁Ⅱ及脂肪干细胞外泌体（ADSC-Exos）单独及联合应用对软骨退变及线粒体自噬的影响,探讨其改善膝骨关节炎（KOA）的作用机制。方法 将40只SD大鼠分为假手术组、模型组、ADSC-Exos组（4×10⁸个/周）、膝痹宁组（8 g·kg^-1·d^-1）和ADSC-Exos（4×10⁸个/周）+膝痹宁（8 g·kg^-1·d^-1）组。采用用前交叉韧带切断术（ACLT）建立膝骨关节炎模型。评估大鼠痛敏状态、微计算机断层扫描技术（Micro-CT）及病理染色检测膝关节及软骨组织退变程度、免疫荧光观察p62和微管相关蛋白1轻链3（LC3）B表达情况、酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-15水平、蛋白免疫印迹法（Western blot）检测基质金属蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、含血小板结合蛋白基序的解聚素金属5（ADAMTS5）、Ⅱ型胶原（ColⅡ）、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）、软骨蛋白聚糖抗体（ACAN）、PTEN诱导激酶1（PINK1）、帕金蛋白（Parkin）、p62、LC3A/B蛋白表达水平。结果 与假手术组比较,模型组大鼠冷刺激缩足阈值及机械痛敏阈值逐渐下降,软骨组织出现不同程度的磨损及缺失,软骨组织退变,血清IL-1β、IL-6、IL-15和TNF-α含量明显升高（P<0.01）,软骨组织中MMP-3、MMP-13和ADAMTS5蛋白表达升高,ColⅡ、TIMP1和ACAN蛋白表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较,各治疗组大鼠冷刺激缩足阈值及机械痛敏阈值升高,软骨组织退变程度减轻,血清IL-1β、IL-6、IL-15和TNF-α含量降低（P<0.05,P<0.01）,软骨组织中MMP-3、MMP-13和ADAMTS5蛋白表达降低,ColⅡ、TIMP1和ACAN蛋白表达升高（P<0.05,P<0.01）;且以Exos+膝痹宁组改变最为明显。结论 ADSCs-Exos及膝痹宁Ⅱ均可以通过促进PINK1/Parkin信号通路表达,提高软骨细胞线粒体自噬水平,延缓软骨组织退变,且二者联用可以增强疗效。     

基于TGF-β1/SMAD3信号通路探讨“易层”贴敷对膝骨关节炎模型大鼠滑膜纤维化的干预机制

目的：观察“易层”贴敷对膝骨关节炎（KOA）模型大鼠滑膜纤维化的干预作用及其对转化生长因子β 1（TGF-β 1）/细胞信号转导分子3（SMAD3）信号通路的影响，探索其对KOA的治疗机制。方法：将27只大鼠随机分为空白组、模型组和易层组，每组9只，模型组和易层组大鼠双膝采用前交叉韧带横断术（ACLT）制作KOA模型。造模成功后第14天开始，易层组采用“易层”贴敷疗法，即先后予复方三黄油膏、三色散敷药敷膝关节，每日贴敷8 h，连续贴敷28 d ；模型组造模成功后不做干预。于易层组干预完成后，同期处死各组大鼠，取膝关节滑膜组织，备测。取每组3只大鼠的膝关节滑膜组织，固定、包埋、切片，分别行苏木精-伊红（HE）染色和天狼星红染色观察纤维化情况。免疫组化法观察每组3只大鼠膝关节滑膜组织TGF-β 1、SMAD3、磷酸化-SMAD3（p-SMAD3）等TGF-β 1/SMAD3信号通路相关指标表达。蛋白免疫印迹（Western blot）法和实时荧光定量PCR（qPCR）法分别检测每组3只大鼠膝关节滑膜组织Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ ）、肌动蛋白α （α-SMA）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP1）、TGF-β 1、SMAD3、高迁移率族蛋白1（HMGB1）的相对蛋白和基因表达量。结果： HE染色和天狼星红染色后病理图片显示，与空白组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织纤维化程度和炎性细胞浸润程度明显加重，易层组较模型组滑膜组织纤维化程度、炎性细胞浸润程度减轻。免疫组化法结果显示，与空白组比较，模型组大鼠膝关节滑膜组织TGF-β 1、SMAD3、p-SMAD3表达明显增多，阳性着色（褐色）密集；易层组大鼠膝关节滑膜组织上述指标表达明显降低，阳性着色稀疏。Western blot法和qPCR法检测结果显示，模型组大鼠膝关节滑膜组织中TGF-β 1/SMAD3信号通路的关键指标HMGB1、TGF-β 1、SMAD3蛋白和基因相对表达明显高于空白组（P<0.05），易层组上述指标的表达则显著低于模型组（P<0.05）；模型组大鼠膝关节滑膜组织中促纤维化相关因子TIMP1、Collagen I、α-SMA蛋白和基因相对表达明显高于空白组（P<0.05），易层组上述指标表达显著低于模型组（P<0.05）。结论：“易层”贴敷可能通过抑制TGF-β 1/SMAD3信号通路活化从而改善滑膜纤维化，延缓KOA进展。     

基于AMPK/mTOR信号通路研究膝痹宁方对膝骨关节炎模型大鼠的改善作用机制

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路探究膝痹宁方（XBN）对膝骨关节炎（KOA）模型大鼠的改善作用机制。方法 将36只大鼠随机分为空白组、模型组、XBN组（12.56 g/kg）、XBN+二甲双胍（AMPK激动剂）组[12.56 g/kg XBN+100 mg/kg二甲双胍],每组9只。除空白组外,其余各组大鼠均通过离断前交叉韧带的方法复制KOA模型。造模成功后,各组大鼠给予相应药物/生理盐水,XBN和生理盐水每天灌胃1次,二甲双胍隔天腹腔注射1次,连续4周。观察大鼠软骨组织病理形态学变化并进行Mankin评分,检测大鼠软骨组织中聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的表达水平,血小板反应蛋白解整合素金属肽酶4(ADAMTS-4)、ADAMTS-5、基质金属蛋白酶3(MMP-3)、MMP-13的mRNA和蛋白表达水平,及AMPK、mTOR蛋白的磷酸化水平。结果 与空白组比较,模型组大鼠软骨组织结构分层紊乱,软骨层基质淡染,潮线出现扭曲或中断,Mankin评分显著升高（P<0.05）;软骨组织中Aggrecan蛋白表达水平和AMPK蛋白的磷...     

基于PI3K/AKT/HIF-1α信号通路研究易层敷贴缓解TGF-β1诱导的膝骨关节炎大鼠滑膜纤维化的机制

目的 探讨易层敷贴对膝骨关节炎(KOA)大鼠滑膜纤维化TGF-β1、α-SMA、COL1A1表达的影响以及对PI3K/AKT/HIF-1α信号通路的调控作用。方法 将30只SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组和易层组,膝关节腔注射200 ng转化生长因子-β1重组蛋白(TGF-β1)建立膝关节滑膜纤维化动物模型,2 d 1次,持续3次,造模14 d后给予易层敷贴外用治疗28 d后取滑膜组织。HE和Masson染色观察滑膜病理变化;免疫组化检测滑膜p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1的表达水平。提取雄性SD大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞(FLSs),以10 ng·mL^-1 TGF-β1诱导24 h建立KOA滑膜纤维化细胞模型,易层冻干粉干预24 h, Western blot检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1的蛋白表达,qPCR检测HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1 mRNA表达。结果 与空白组相比,模型组HE染色滑膜炎加重(P<0.01...