甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体（PTHR）及其突变受体（DSEL）全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及
DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素（PTH）模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方
法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1（+）,二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切,经T4
DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1（+）中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoR
Ⅰ与Not Ⅰ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL及空质粒pcDNA3.1
（+）分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重
组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）- DSEL
构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在
重组质粒表达载体pcDNA3.1（+）-PTHR、pcDNA3.1（+）-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL
基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高
于空质粒pcDNA3.1（+）转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该
稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。
     

甲状旁腺激素通过非依赖PLC的PKC途径抑制成骨细胞的凋亡

目的观察甲状旁腺激素的非依赖PLC的PKC转导通路（PTH/nonPLC/PKC）是否会对成骨细胞（MC3T3-E1）的凋亡以及 细胞数量具有影响。方法培养MC3T3-E1细胞,以1.5×104密度接种到96孔板,然后置于培养箱培养3 d直到细胞达到汇合状 态,随机分为5 组：按100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）;100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）;100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH （1-34）+1 μmol/L Go6983,1 μmol/L Go6983;空白对照组加入等体积的去离子水,分别刺激细胞1、24、48 h,然后使用细胞计数 试剂盒（CCK-8）和Caspase-Glo® 3/7试剂盒（caspase-3）检测细胞的细胞数量与凋亡。结果CCK-8检测结果显示,［Gly1, Arg19］ hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）+Go6983组相比,在1 h和24 h具有提高细胞数量的趋势,但结果并没有统计学差异, 48 h［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）组相比,可以明显提高细胞的数量（P<0.05）。进一步的研究发现在 ［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组添加抑制剂Go6983 后,细胞数量增多的效应消失（P<0.05）。Caspase-3 检测凋亡结果显示,［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）+Go6983组相比,在1 h和24 h具有抑制细胞凋亡（细胞凋亡受到抑制）,但是差 异无统计学意义。48 h检测细胞凋亡显示,［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）组与［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）组相比,前者可以明显抑制细 胞凋亡（P<0.05）,给予PKC抑制剂Go6983后,其抑制凋亡现象消失。结论PTH的nonPLC/PKC信号转导通路可能在长时间 （48 h）作用于MC3T3-E1细胞时,可抑制细胞凋亡,提高细胞的数量。     

关于中药口服液澄清度控制的思考

目的介绍中药口服液工艺制作流程。方法通过对中药口服液澄清度的认识,以水提醇沉法为例,阐明了控制中药口服液的澄清度,既要尽可能多地去除杂质,又要兼顾保护有效成分的观点。结果与结论希望随着中药提取纯化技术的进步,会有更多、更好的品种问世。     

倍他洛尔的合成工艺改进

以对溴苯酚为原料,经苄基化、Grignard反应、烃化、脱苄基、烃化、胺化、成盐反应合成倍他洛尔,7步反应总收率为21.8%.其结构经红外光谱、质谱、核磁共振氢谱、元素分析确证.在制备4-[2-(环丙基甲氧基)乙基]-1-苯甲氧基苯(4)中使用了相转移催化剂代替NaH,收率达到98%.化合物4的脱苄反应,由加压反应改为常压反应,收率为80%.     

丸剂合理分批方法与批量验证方案

目的探讨丸剂合理分批的方法，并建立丸剂批量验证方案。方法通过推理和试验验证，提出了丸剂合理分批方法。结果将一批药粉和一批提取物制成一批丸剂，且批量应是日生产能力的0．5～1倍，这是比较合理的分批方法。结论该分批方法不影响产品的均一性，合理可行，适用于大生产。     

甲状旁腺激素（1-34）对小鼠肺癌骨转移瘤生长的影响

目的通过建立肺癌骨转移小鼠模型,探讨甲状旁腺激素（PTH）（1-34）对小鼠肺癌骨转移瘤生长的影响。方法将30只4~
6周龄BALB/c雌性小鼠,用人肺癌A549细胞悬液骨内注射的方法制作胫骨近端肺癌骨转移模型,7 d后X线确定模型建立,随
机分成3组,一组注射甲状旁腺素（PTH）（1-34）（40 mg/kg）作为观察组,一组注射等量溶解剂作为空白对照组,一组注射环磷酰
胺作为阳性对照组,每2 d测体质量一次及观察右后肢瘤体生长情况,给药28 d后处死小鼠,所有小鼠行X线及显微CT检查观
察肿瘤形态、大小,CT检测胫骨局部骨密度及肿瘤体积,HE染色及免疫组织化学法观察肿瘤形态及性质,检测血清碱性磷酸酶
浓度了解成骨情况。所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析,体质量以均数±标准差表示,ALP、肿瘤体积及CT数据分析采
用单因素方差分析做整体检验,两两比较采LSD-t检验,P<0.05被认为差异有统计学意义。结果观察组小鼠体质量变化曲线
与对照组组间差异无显著性（P>0.05）,X线及显微CT可见观察组及对照组均出现明显的骨破坏缺损,环磷酰胺组骨皮质相对
完整,轻度骨破坏,CT数据分析观察组及对照组肿瘤体积大小组间差异无显著性（P>0.05）,环磷酰胺组肿瘤体积明显小于前两
组,组间有显著性（P<0.05）,而观察组骨量大于对照组,低于环磷酰胺组,3组组间差异有显著性（P<0.05）,病理学显示溶骨性病
变为主的混合性骨质破坏,观察组及对照组骨结构破坏严重,肿瘤细胞填充明显,免疫组化显示腺瘤,两组差异相似,观察组
ALP浓度大于对照组及环磷酰胺组,观察组与对照组及环磷酰胺组相比,组间差异有显著性（P<0.05）。结论间歇性小剂量注
射甲状旁腺激PTH（1-34）不促进小鼠肺癌骨转移瘤的生长,但增加骨转移瘤灶周围的骨量。
     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切,经T4DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL及空质粒pcDNA3.1(+)分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高于空质粒pcDNA3.1(+)转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。     

甲状旁腺素非PLC依赖PKC通路激活增强成骨细胞CITED1表达

目的通过相关信号通路屏蔽和基因表达分析,探讨甲状旁腺素（PTH）非PLC依赖PKC信号转导途径（PTH/nonPLC/
PKC）的功能,分析其对骨代谢的影响。方法取2~3 d C57BL乳鼠颅盖骨分离培养成骨细胞,取贴壁生长的第1代细胞,随机分
为4 组：100 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-28）（简称GR（1-28））+10 nmol/L RP-cAMP;10 nmol/L［Gly1, Arg19］hPTH（1-34）
（简称GR（1-34））+10 nmol/L RP-cAMP;10 nmol/L PTH（1-34）及空白对照组加入等体积的0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid,
TFA）,作用4 h后,提取各组总RNA,行小鼠全基因组表达谱芯片分析,筛选出可能与nonPLC/PKC信号转导通路相关的差异表
达基因,并进行相关通路分析。RT-PCR 筛选及验证上述差异表达基因。培养MC3T3-E1 细胞,分为4 组：GR（1-28）+
RP-cAMP;GR（1-34）+RP-cAMP;GR（1-34）+RP-cAMP+100 nmol/L Go6983 及空白对照组,RT-PCR 法验证比较GR（1-28）和
GR（1-34）引起的基因表达变化情况。结果倒置相差显微镜观察示,培养7 d见细胞排列紧密,为三角形或多边形,呈铺路石样;
细胞培养14 d ALP染色可见胞质中出现蓝染颗粒,成骨诱导培养28 d茜素红染色可见红色矿化结节形成。基因芯片分析结果
中筛选出与PTH的nonPLC/PKC 信号转导通路相关性最大的56 个基因,进行RT-PCR 验证后发现CITED1 的表达量在GR
（1-34）+RP-cAMP组显著高于GR（1-28）+RP-cAMP组及空白对照组,但小于PTH（1-34）组（P<0.05）。MC3T3-E1细胞RT-PCR
验证的结果与其一致,在阻断cAMP/PKA信号通路后,仅CITED1基因表达量在GR（1-28）和GR（1-34）刺激时存在显著不同,
且加入PKC抑制剂（Go6983）后,表达差异消失。结论PTH的nonPLC/PKC信号转导通路的激活能够使得成骨细胞CITED1
的表达量明显升高,介导PTH对成骨代谢的作用。该途径不依赖PLC和PKA信号的激活。