DNA条形码技术在兰州中川机场鼠类鉴定中的应用

目的调查兰州中川机场及其附近地区鼠类的组成,并利用DNA条形码技术对鼠种进行鉴定。方法 2015年1月—2017年7月,在中川机场及其附近地区采用笼夜法采集鼠类,提取鼠肾DNA,用PCR方法扩增线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因并测序,测序结果在DNA条形码专用数据库BOLD中进行比对,确定鼠种。利用Mega 6.0构建分子进化树。对于形态学和COⅠ基因鉴定结果不一致的样本,进一步通过细胞色素b(Cytb)基因进行分子鉴定。结果 118份样品均能扩增出特异性COⅠ基因片段,115份样本的分子鉴定结果与形态学结果基本一致,3份样本形态学鉴定结果与分子鉴定有差异,经Cytb基因序列比对及形态学反复鉴定,确定初步形态学鉴定结果有误,采用分子鉴定结果。结论 DNA条形码技术可以对鼠类进行有效鉴定,是对形态学鉴定的有力补充,为口岸病媒生物的快速识别和鉴定提供了科学依据。     

DNA条形码技术在人体排出未知昆虫幼虫鉴定中的应用

目的 使用DNA条形码鉴定方法对两名儿童从尿道排出的不明昆虫幼虫进行鉴定,解决未知昆虫幼虫无法利用传统形态学鉴定方法进行鉴定的难题,为主诊医生后期制定针对性治疗方案提供科学依据。方法 以家长收集并送检的患儿从尿道排出的不明活体昆虫幼虫为材料,先进行图像采集和形态学描述,然后取部分昆虫幼虫组织提取基因组DNA,利用多细胞无脊椎动物线粒体细胞色素氧化酶I（COI）的通用引物进行DNA扩增,PCR产物直接从两端测序,DNA测序结果以MEGA6软件验证图谱确定为有效序列后,经拼接、去除通用引物序列,最终得到658 bp 的COI基因片段碱基序列。上传数据与GenBank和BOLD数据库 中的序列进行同源性比对,建立系统发育树。结果 序列测定结果与GenBank和BOLD中公布的白斑蛾蚋（Clogmia albipunctata）的 COI序列相似性为100%。选取GenBank 中与目的片段核苷酸序列比较所得相似性较高的7种物种序列,以红头丽蝇为外群,构建NJ树,发现昆虫幼虫的序列以及GenBank中的白斑蛾蚋聚为一类,毛蠓科的全部物种聚成一支,置信度高达100%。结论 根据实验结果可以判断这两名儿童从尿道排出的不明昆虫活虫为白斑蛾蚋的幼虫。DNA条形码技术不仅可以快速准确识别物种种类,还能鉴定近缘种,发现隐存分类单元,是对非成虫发育形态昆虫的快速、准确的种类鉴定方法,可以有效弥补形态学鉴定方法的不足。     

环介导等温扩增法检测进口宠物乳粉中阪崎肠杆菌

目的:建立并验证一种能够简单,准确和快速检测进口宠物乳粉中阪崎肠杆菌的方法。方法:应用环介导等温扩增技术(LAMP)建立宠物乳粉中阪崎肠杆菌检测方法,并通过常规方法对其结果进行验证。结果:LAMP方法从5种进口宠物乳粉中检出两份阪崎肠杆菌阳性,与VITEK 2生化鉴定结果一致。结论:该方法特异性好、灵敏度高,检测时间短,适用于奶粉及其他食品中阪崎肠杆菌检测。     

猪卵透明带—4蛋白在大肠杆菌中高表达的研究

目的：在大肠杆菌中高水平地直接表达目的蛋白,方法：用PCR方法从猪卵透明带－1(pZP1)cDNA中扩增pZP4目的基因片段,通过在其5′端和3′端引入的双酶切位点将该完整的目的cDNA定向插入pBV221表达质粒PRPL启动因子下游的多克隆区。结果：此重组表达质粒转化宿主工程菌后经热诱导培养,可在SDS－PAGE凝胶上得到特异性的高表达蛋白条带,而且它在Western blot鉴定实验中能被鼠抗pZP4的单克隆抗体17D3和兔抗pZP IgGs识别。结论：成功地在大肠杆菌高效表达了可被17D3单克隆抗体及ZP多克隆体识别的ZP4。     

医学媒介生物微量组织直接扩增DNA条形码序列方法的研究

目的 为保证DNA条形码序列模板DNA来源的单一性,和最大程度减少凭证标本的形态破坏,建立一种从医学媒介生物微量组织中免提取,直接扩增DNA条形码序列的方法。方法 以螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块为材料,通过优化裂解液浓度、裂解液和缓冲液配比,优化反应体系和反应条件,用KOD FX DNA聚合酶进行DNA条形码序列的直接扩增,反应产物测序,与NCBI基因库中的序列进行比较以验证其是否被污染。结果 裂解液优化为NaOH 50 mmol/L;裂解液和缓冲液配比优化为9∶1;反应体积优化为每50μl反应体系中2×KOD FX DNA聚合酶buffer（含Mg2 ＋）25μl、2mmol/LdNTP10μl、KOD FX DNA聚合酶（1U/μl）1μl、正向引物LCO1490（20μmol/L）、反向引物HCO2198（20μmol/L）各1μl;反应条件优化为：95℃3 min;98℃10 s,50℃30 s,68℃1 min,35个循环;68℃7 min。测序结果显示无污染,均为有效序列。结论 该方法操作简单而且省去了DNA提取的步骤,节约了时间和费用,适合螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块DNA条形码序列的直接扩增。     

河南口岸截获未知蝇种细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因分析

目的应用DNA条形码技术对河南口岸截获的1只形态不完整的未知蝇类进行鉴定。方法利用以细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)为目的基因的DNA条形码技术,对该未知蝇类基因组DNA进行扩增、序列比对和分析。结果通过DNA条形码鉴定和序列比对,该未知蝇类的DNA条形码序列与BOLD中绯颜裸金蝇的序列同源性高达100%,确认该蝇种为绯颜裸金蝇。结论 DNA条形码技术弥补了传统形态学鉴定的局限性,在国境口岸医学媒介生物鉴定中有广阔的应用前景。     

粗野粉蝇的DNA条形码和形态鉴定

目的应用DNA条形码与形态分类相结合鉴定中山口岸入境船舶截获的雌性蝇类。方法 2015年3月26日,在中山小榄港口岸对截获的爱尔兰进口废旧瓦楞纸箱中的雌性蝇类进行DNA条形码与形态鉴定;与相似种伪粗野粉蝇进行形态与DNA条形码的比较。结果所截获的蝇类为雌性粗野粉蝇;粗野粉蝇与伪粗野粉蝇在形态上的区别较细微,而在658 bp的DNA条形码序列上有32个核苷酸的差异,差异高达4.86%,远大于DNA条形码2%的种判断界限。结论应用DNA条形码与形态分类相结合方法可以准确快速鉴定蝇类。     

中山口岸截获国内未见分布染色硬翅蠊的鉴定

目的通过准确地鉴定中山口岸入境船舶截获的蜚蠊,为今后口岸鉴定该种蜚蠊提供参考依据。方法2017年2月24日在中山口岸截获的圭亚那进口原木中截获1只雄性蜚蠊,对其进行形态鉴定及描述,获取其DNA条形码序列并提交至GenBank。结果经形态鉴定,该雄性蜚蠊为染色硬翅蠊,隶属于蜚蠊目姬蠊科。经科技文献查新,确认为我国未见分布种且为国内口岸首次截获。结论 DNA条形码是形态鉴定的强有力补充,DNA条形码数据库有待完善和补充,应用形态鉴定和DNA条形码相结合可准确快速地鉴定外来蜚蠊。     

猪卵透明带-3α基因在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的通过遗传工程获得ＺＰ３α融合蛋白,以便用表达产物制备ＺＰ３α单克隆抗体。方法根据重新测序的猪ＺＰ３αｃＤＮＡ５＇端非编码碱基数,ｐＷＲ４５０表达质粒家族的ｐＷＲ４５０－２被选用来表达β－半乳糖苷酶（ＬａｃＺ）／ＺＰ３α融合蛋白。带５＇端非编码区和信号顺序的全长ＺＰ３αｃＤＮＡ片段,用ＥｃｏＲⅠ酶切自ｐＺ５８质粒,然后被重组插入ｐＷＲ４５０－２质粒中被截短ＬａｃＺ＇基因的３＇端多克隆区。此重组质粒转化大肠杆菌ＴＧ１后,ＺＰ３α融合蛋白的表达通过ＩＰＴＧ诱导。结果在１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ存在下可观察到ＬａｃＺ／ＺＰ３α融合蛋白在大肠杆菌中的表达,表达量约占总细菌蛋白的５％。在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上,融合蛋白显示相对分子质量为１０．２×１０４。在蛋白印迹实验中,融合蛋白显示了与兔抗猪ＺＰＩｇＧ的特异免疫学反应。结论猪ＺＰ３α融合蛋白的可获得性将有助于今后开展制备抗ＺＰ３α单抗和评价它的抗生育功效等研究