重组人胰岛素类似物蛋白在大肠杆菌中克隆、表达与纯化

目的:设计合成编码Des30、B26 H、B28D和B26 H-B28D基因,用大肠杆菌BL21(DE3)表达上述4种速效人胰岛素原蛋白,为探知B26 H-B28D功能和用植物系统表达速效胰岛素原类似物研究做必要的准备。方法:基于人胰岛素氨基酸和小C肽(TYPGDVPK)序列,按植物(油菜)偏爱密码子设计合成了198 bp编码人速效胰岛素原基因Des30。随后以Des30为模板,用PCR突变技术扩增并创造了基因B26 H、B28D和B26 H-B28D,并构建了4个原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导、用Ni-NTA亲和柱纯化、复性、胰岛素体外成熟(酶解)获得重组人胰岛素突变体蛋白。结果:4种人速效胰岛素原类似物在宿主菌中均以包涵体形式存在,IPTG诱导时间以8 h为佳。Western blot结果表明,带his-tag的速效人胰岛素原蛋白已成功在宿主菌中表达,用Ni-NTA亲和柱纯化获得了较纯的速效人胰岛素原蛋白。纯化的包涵体蛋白通过低温透析复性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,Western blot结果显示,释放出的单体胰岛素与阳性对照一样具有免疫活性,RP-HPLC和MALDI-TOF质谱检测表明,酶切产物分子量峰值分别与预测的人胰岛素类似物分子量一致。结论:该研究为B26 H-B28D功能研究和用植物系统表达人类胰岛素的研究奠定基础。