HPV-16 E4原核表达系统的建立和表达特性研究

目的克隆人乳头瘤病毒-16型(HPV-16) E4 基因( E4 ),构建E4蛋白表达重组工程菌,探索表达条件和鉴定表达产物特性.方法以临床HPV-16阳性宫颈炎患者上皮细胞提取物为模板,PCR扩增 E4 完整基因,并定向克隆到pET32a(+)原核表达质粒中,经双酶切和测序鉴定后转入大肠杆菌BL-21(DE3),获得工程菌(BL-21/E4).经IPTG诱导,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果克隆到完整 E4 基因为342 bp,与HPV-16东亚型的同源性为99%,与其他HPV16型的同源性高于97%.在28 ℃和37 ℃,0.1 mmol/L的IPTG诱导18 h时,重组蛋白(rE4)表达量分别占菌体总蛋白的12.2%和12.8%;SDS-PAGE和Western blot证明rE4蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约34×103的可溶性融合蛋白(rE4/His).结论成功构建了表达带标签的融合重组蛋白(rE4/His)的重组大肠杆菌BL-21/E4表达系统,这为高纯度HPV-16 E4蛋白的制备和相关研究奠定了基础.     

大鼠干扰素诱导蛋白-10真核表达质粒的构建及其在NIH 3T3细胞中的表达

目的构建大鼠干扰素诱导蛋白-10（IP-10）基因的真核表达质粒，并研究其在NIH 3T3细胞中的表达情况。方法通过PCR获得实验所需的IP-10基因片段，通过酶切IP-10基因片段、真核表达质粒载体pEGFP—cl和连接反应，构建IP-10的真核表达质粒pEGFP—cl—IP-10，重组质粒经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定证实构建成功后，用PolyFect脂质体转染NIH 3T3细胞，然后用免疫荧光技术检测pEGFP—cl—IP-10在NIH 3T3细胞中的表达。结果酶切分析、PCR及DNA序列测定证实，IP-10基因片段被成功克隆人真核表达质粒载体pEGFP—cl，免疫荧光技术检测证实，该基因能在NIH 3T3细胞中表达。结论证实IP-10基因可在NIH 3T3细胞中表达，为将其作为DNA疫苗治疗自身免疫性疾病的研究奠定了基础。     

原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤临床诊疗初步经验

目的探讨原发性中枢神经系统淋巴瘤影像学特点及临床诊疗经验。方法对15例确诊为原发性中枢神经系统恶性B细胞型淋巴瘤患者的临床资料进行回顾性分析。结果颅内中枢神经系统原发性恶性淋巴瘤好发于脑深部组织如基底节区、小脑半球等，肿瘤T1加权像多为等或低信号，R加权像多呈高信号，也可以为等信号，DWI像呈高信号。增强扫描见病变明显均匀强化，边缘有多个小突起，似树枝状改变。10例患者行手术切除治疗，5例行组织活检．术后病理组织学及免疫组化检查证实为B细胞型淋巴瘤，术后14例行直线加速器电子线放疗及激素治疗，1个月后复查提示肿瘤明显变小；1例术后放弃放疗，给予激素治疗，肿瘤明显变小，但易复发。结论病变明显均匀强化及树枝状改变为原发性中枢神经系统淋巴瘤MRI特征，缺乏特异性；MRI表现及诊断性激素治疗有助于术前诊断，手术切除病理组织后行激素及放疗可延长患者生存期，但肿瘤容易复发。     

小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究

目的构建小鼠β防御素3（mouse βdefensin3,mBD3）基因的原核表达载体pET-32a（＋）／mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a（＋）原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami（2）,用畀丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠B防御素3（fmBD3）的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体PET-32a（＋）／mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌元作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。     

H12单克隆抗体荧光标记活体脑胶质瘤的实验研究

目的 :识别肿瘤边界 ,确保正常神经组织不受损伤的前题下更完全地切除脑胶质瘤。方法 :FITC标记的单克隆抗体 40 0 μg/只 ,腹腔注射或局部点染脑胶质瘤C6细胞颅内肿瘤裸鼠模型 ,共聚焦激光扫描显微镜观察。结果 :C6胶质瘤本身和肿瘤瘤周水肿区被染成绿色 ;正常脑组织未被染色 ;镜下可以辨别经FITC标记单克隆抗体特异结合的肿瘤组织与正常脑组织之间的界限 ,瘤周水肿区存在一个显著的荧光辉度渐变带。结论 :该显像技术可用于肿瘤边界的确定 ,为脑胶质瘤显微外科手术的彻底性提供了理论和实践基础     

甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒，并研究其在真核细胞中的表达。方法 根据Genbank（NCBI ISDN13425）中查得的M2e编码序列，设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端，退火后使之互补结合成为M2e编码序列；然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2ef经酶切和DNA测序鉴定后，转染HEK293细胞。用免疫荧光技术检测pcD—NA3．1（＋）-M2e在HEK293细胞的表达。并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链，插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3．1（＋）-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上，转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖，表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2e，表达的M2e蛋白不仅存在于绳胞膜上，也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。     

西南地区藏族和彝族人群的HLA—A、B和DR抗原的分布调查

本文报导西南地区72例藏族和75例彝族的HLA—A、B和DR抗原分布调查,并和以前调查的汉族结果进行对比。结果表明三个民族HLA抗原的分布基本轮廓相似,但在某些抗原频率上,三个民族间有明显差异(P<0.05或P<0.01)。藏族的A2、A3和DR4偏高,未发现Aw23、B14和B18;彝族的B7和DR5偏高,未发现A3、Aw23和B37;汉族的B13、B17和DR3偏高,未发现A25。本文还对比了纯藏、纯汉和藏汉混血者三个群体的HLA分布,并进行了讨论。     

流感病毒受体结合表位真核载体的构建及表达

目的构建甲型流感病毒血凝素(HA)信号肽(SP)与HA唾液酸受体结合部位(RB)所含T、B表位的基因片段(RBT、RBB)真核表达质粒,研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将HA的SP分别与RB、RBT、RBB通过一段多肽接头Gly4Ser融合为SP-RB、SP-RBT和SP-RBT,将其分别插入pcD-NA3.1(+)载体,构建质粒,鉴定正确后转染MDCK细胞,RT-PCR、免疫荧光、MTT检测该质粒的表达和分泌。结果融合基因真核表达质粒构建成功,在MDCK细胞中成功表达,转染细胞培养上清能刺激淋巴细胞增殖。结论SP-RB、SP-RBT、SP-RBB真核表达载体成功构建,表达产物能刺激淋巴细胞增值,为流感病毒唾液酸受体结合部位的T、B细胞表位免苗研究提供初步依据,也为流感核酸疫苗的研制奠定了基础。     

IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定

目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法首先采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL-18PE38,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,再转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果酶切分析、PCR鉴定和DNA测序等证实,IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-1818的特异性抗体所识别。结论IL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。     

一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes真核表达质粒的构建及功能

目的 构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒,并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法 通过RT-PCR的方法,从小鼠肝脏中获得Rantes基因;将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SRα中,构建成重组质粒;重组质粒转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆;限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒,并进行DNA序列分析;用脂质体介导法转染NIH3T3细胞,免疫荧光检测重组质粒的表达情况;MTT法测定DT390-Rantes的表达活性。结果 经过酶切分析及DNA测序证实,Rantes基因正确插入到真核表达质粒SRα中,并在NIH3T3细胞中表达;MTT法证实,重组免疫毒素DT390-Rantes能在体外杀伤活化的T细胞。结论 成功地构建了一种新型重组免疫毒素真核表达质粒DT390-Rantes-SRα,该质粒可在真核细胞中瞬时表达,其转染上清对活化的T细胞具有杀伤作用。