聚合酶链反应检测患儿尿标本中的巨细胞病毒DNA

本文建立了聚合酶链反应(PCR)检测人巨细胞病毒(HCMV)方法,探讨了该方法的某些实验条件。用PCR检测24例临床患儿尿标本。证明PCR方法特异、敏感、简便而快速。同科不同属病毒如HSV、EBV等以及人源正常细胞均无假阳性结果:最小检出量可达0.1fg DNA,相当于6个基因拷贝;用水浴箱手控时间即可进行PCR循环,30次循环仅需97min30s;PCR和DNA杂交检测尿标本中HCMV阳性例数分别为20和14例。该结果证明HCMV感染儿童的广泛性和严重性,初步表明儿童肾病综合症与HCMV有关。     

人巨细胞病毒PCR检测技术的建立及应用研究

本研究在国内率先建立了检测人巨细胞病毒(HCMV)的PCR技术,并用于基础与临床,为HCMV的研究和诊断提供了先进的手段与工具。本研究HCMV—PCR的特异性和敏感性均达到国际先进水平(0.1fg)。应用HCMV—PCR探讨了临床上许多新课题:(1)血液中HCMV—DNA的检出与分析,不仅筛选了献     

表达CS3菌毛和CT—B抗原双价疫苗候选株的构建

肠毒素性大肠杆菌（ＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＥＴＥＣ）是引起幼儿腹泻和旅游者腹泻的重要致病菌。本研究的目的是构建既具有抗菌能力又有中和毒素能力的工程菌株。本研究以Ｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ质粒为载体构建了表达ＣＳ３和ＣＴ－Ｂ的双价重组抗原的克隆株。口服免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠和肌肉注射免疫家兔，该重组菌株可以诱发抗ＣＴ－Ｂ和抗ＣＳ３的双重免疫应答，为构建多价腹泻疫苗株奠定了基础。     

不耐热肠毒素和耐热肠毒素基因的融合

用重组基因技术将产肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的耐热肠毒素（ＳＴａ）基因与不耐热肠毒素Ｂ亚单位（ＬＴ－Ｂ）基因融合。表达的ＬＴＢ／ＳＴａ融合蛋白，既有ＬＴ－Ｂ的抗原性又有ＳＴａ的抗原性。由于基因融合的方式不同，对ＳＴａ的抗原性影响很大，但对ＬＴ－Ｂ的抗原性没有影响。ＬＴ－Ｂ／ＳＴａ融合多肽保留了ＥＴＥｃ肠毒素结合ＧＭ－１神经节甙酯的能力，却仍具有ＳＴａ的生物毒性。     

CS3基因的克隆及结构分析

定居因子是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子之一。它在ETEC对肠粘膜上皮细胞的粘附过程中起着重要的介导作用。在已知的定居因子中,CFA/Ⅱ为优势血清型定居因子抗原之一,它由CS1、CS2和CS3三种组分所构成。其中CS3组分为CFA/Ⅱ阳性菌的共有抗原。本工作运用DNA体外重组方法克隆了CS3基因,并对其结构进行了分析。     

人源肠毒素大肠杆菌CS3伞毛抗原结构基因的克隆…

利用体外基因扩增技术（ＰＣＲ）和ＤＮＡ重组技术，扩增克隆了人源肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的ＣＳ３伞毛抗原的结构基因。核苷酸序列分析证实克隆的ＤＮＡ片段长度为６０４核苷酸对（ｂｐ）。在该序列中含有单个开放阅读框架，并具有－１０区和－３５区启动子序列以及核糖体结合位点。根据核苷酸序列推导，ＣＳ３结构基因编码１６８个氨基酸。其中前１５个氨基酸为可能的信号肽部分。在该基因编码的氨基酸中，疏水氨基酸约占４６     

人源肠毒素大肠杆菌CS3纤毛基因的克隆及表达

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹结果证明在ＣＦＡ／Ⅱ阳性菌Ｅ４４８１５的诸多质粒中，编码ＣＳ３纤毛抗原的质粒为一约为６０ＭＤ的大质粒；当这些质粒用ＨｉｎｄⅢ消化时，该抗原的编码基因位于５．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上。回收该片段并插入到载体质粒ｐＢＲ３２２的ＨｉｎｄⅢ位点，构建了Ｅ．ｃｏｌｉＥ４４８１５株质粒的有限基因库。通过筛选，获得了两种插入方向的阳性重组子。全细胞ＥＬＩＳＡ测定结果表明，只有当插入片段的转录方向和载体质粒中的ｐ１启动子的转录方向一致时，重组质粒才能有效地表达ＣＳ３纤毛抗原；宿主不同时表达水平存在一定差异。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹试验表明：ＣＳ３纤毛抗原有两种不同的单体形式，分子量大约分别为１５．０ｋＤ和１５．５ｋＤ。ＣＳ３纤毛抗原编码基因的克隆为研究ＣＳ３基因表达调控和研制预防ＥＴＥＣ腹泻疫苗打下了基础。     

毒素源性大肠杆菌CFA/Ⅰ、CS3重组菌株粘附力、免疫原性和保护性研究

采用可逆性肠结扎成兔腹泻(RITARD)动物模型检测了毒素源性大肠杆菌(ETEC)定居因子抗原Ⅰ(CFA/I)和表面抗原3(CS3)重组菌各1株的肠道粘附力,免疫原性和保护性。经肠道及口服接种重组菌株对肠道均有较强的粘附力,与CFAs阴性宿主菌相比P<0.0025。口服免疫家兔时,第4周血清抗体滴度达到高峰,滴度分别为1:9000和1:80000;肠道免疫家兔后血清效价在第2周达到高峰,滴度分别为1:8000和1:60000。在抗体滴度高峰时进行ETEC野生株攻毒,结果显示口服组抗腹泻保护率为66.7％～75％,肠道组为50.1％～71.4％。攻毒后免疫家兔的排菌天数较对照组明显减少。