人SNCA基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的:构建含人野生型及致病突变A30P、A53TSNCA基因的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并通过稳定转染获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein(SNCA)的单克隆PC12细胞株.方法:通过RT-PCR方法扩增SNCA基因,T-A克隆后测序.在此基础上利用单核苷酸差异引物定点诱变法相继构建含SNCA基因编码区EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ两酶切位点的同义突变及其致病突变G88C(Ala30Pro)、G209A(Ala53Thr)的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA,并以PCR、双酶切、测序鉴定.以重组质粒pEGFP-C3-SNCA通过脂质体转染方法转染PC12细胞;以G418进行筛选;以有限稀释法进行亚克隆获得稳定过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株,并以稳定转染pEGFP-C3的PC12细胞作为对照组细胞,通过RT-PCR、Western blot及荧光显微镜鉴定各单克隆PC12细胞株.结果:PCR、酶切及测序证明重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA构建成功.RT-PCR、Western blot及荧光显微镜确认目的基因序列在PC12细胞稳定过表达.结论:成功地构建SNCA基因WT及A30P与A53T突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA;成功获得过表达人野生型及致病突变A30P、A53T α-synuclein的单克隆PC12细胞株.     

增龄对大鼠运动功能和纹状体多巴胺转运体的影响

目的 观察增龄对大鼠运动功能、纹状体多巴胺转运体(DAT)功能和蛋白表达的影响.方法 旋转棒潜伏期测定各增龄组大鼠运动功能;131 I-FP-β-CIT(N-(3'-氟丙基)-2β羰甲氧基-3β(4'-碘苯基)托烷摄取率测定纹状体DAT结合活性;Western-blot检测DAT蛋白表达水平.结果 大鼠旋转棒潜伏期和纹状体131 I-FP-β-CIT摄取率在6月龄后均呈随龄性降低,12、16月龄和20月龄与6月龄组比较差异有统计学意义(P＜0.001),且二者有相关性(r=0.656,P＜0.01);纹状体DAT蛋白表达水平未见随龄性改变.结论 大鼠运动功能的随龄性衰退与纹状体DAT131 I-FP-β-CIT结合活性下降有关;老龄大鼠纹状体DAT可能存在突触膜表达减少.     

突变型α-核突触蛋白的自噬性降解途径及可能机制

目的 观察突变型α-核突触蛋白对PC12细胞增殖的影响和可能的降解途径,探讨其在帕金森病发病机制中的作用.方法 对转染了α-核突触蛋白(A30P)的PC12细胞进行药物干预,检测细胞的增殖活性,并采用透射电镜观察细胞超微结构改变以及自噬的特征性改变,同时检测α-核突触蛋白的表达和超氧化物歧化酶(SOD)的水平.结果 (1)Western Blot法检测α-核突触蛋白的表达:A30P+渥曼青霉素组(A30P+W组)、A30P+1-甲基4-苯基吡啶组(A30P+MPP+组)较A30P组明显增高,以A30P+W组最为明显;而A30P+雷帕霉素组(A30P+R组)条带较A30P组减低(P＜0.01);(2)不同时间点细胞培养液中SOD水平(U/ml)的测定:用MPP+处理转染了突变型α-核突触蛋白的PC12细胞后,培养液中SOD水平(A30P+MPP+组:3 h:97.49±13.8;12 h:102.7±12.7:24 h:101.5±11.8;48 h:104.3±12.4)较A30P组在各时间点显著下调(t=3.7721,P=0.0017);A30P+R组在给药12 h以后,培养液中SOD水平逐渐升高,其中在24 h(121.2±13.0)、48 h(124.3±14.1)和72 h(127.7±13.7)时与A30P+W组比较差异有统计学意义(t=2.9746,P=0.0083);突变型α-核突触蛋白激活了自噬途径,并介导了MPP+的毒性作用,自噬抑制剂渥曼青霉素可通过抑制自噬而加剧α-核突触蛋白积聚,导致细胞死亡;而自噬诱导剂雷帕霉素则可以通过诱导自噬的发生而促进α-核突触蛋白的降解和细胞生长.结论 α-核突触蛋白的异常积聚导致PC12细胞的自噬性细胞死亡,促进自噬有助于突变型α-核突触蛋白降解,对细胞具有保护作用.     

以“蛛网膜下腔出血”首诊的颅内静脉系统血栓形成1例并文献复习

正颅内静脉系统血栓形成(cerebral venous sinus thrombosis,CVST),多急性或亚急性起病,是相对少见的脑血管病,约占脑血管病的0.5%~1.0%~([1,2]),伴有蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)和皮质出血及Todd瘫痪的则更为罕见。经检索中国知网、万方数据库、Pub Med等数据库,多数文献报道仅0.5%~0.8%CVST患者合并SAH~([3,4]),也有文     

Necrostatin-1对6-OHDA致PC12细胞氧化应激损伤的影响

目的研究Necrostatin-1(Nec-1)对帕金森病(Parkinson's disease,PD)细胞模型线粒体失能的影响,探讨Nec-1在帕金森病发病机制中的作用。方法经不同浓度Nec-1预处理的PC12细胞加入6-OHDA建立多巴胺能神经元损伤模型。用4-甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测PC12细胞活力,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,免疫印迹法检测Cathepsin B与Bcl-2蛋白表达。结果 100μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞24h,细胞活力较正常对照组明显降低(P<0.05);与模型组比较,5、10、20、30、60μmol/L的Nec-1可明显减轻6-OHDA的毒性,90μmol/L的Nec-1可加重6-OHDA的毒性。Nec-1可阻抑线粒体膜电位下降。与正常对照组相比,模型组Cathepsin B表达明显增加而Bcl-2的表达显著降低(P<0.05)。与模型组相比,Nec-1与UTI可降低Cathepsin B表达并使Bcl-2的表达逐渐增加(P<0.05)。结论 Nec-1在一定的浓度范围内可提高PC12细胞存活力,通过稳定线粒体膜电位、抑制Cathepsin B的表达、上...     

银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞氧化应激的影响

目的探讨银杏叶提取物（Ginkgo bilobaextract,GBE）对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OH-DA）诱导的PC12细胞氧化应激的保护作用及其机制。方法经不同剂量GBE预处理体外培养的PC12细胞后,加入6-OHDA诱导多巴胺能神经元损伤模型。用MTT法检测PC12细胞活力;分光光度法测定细胞过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活性和总抗氧化能力（T-AOC）的水平;硫代巴比妥法测定细胞丙二醛（MDA）含量。结果100μmol/L的6-OHDA处理PC12细胞24 h,细胞活力较正常对照组明显降低（P〈0.01）,CAT、GSH-Px、T-SOD的活性和T-AOC的水平明显降低（P〈0.05）,MDA含量明显升高（P〈0.05）;与模型组比较,不同剂量GBE预处理组的PC12细胞活力逐渐升高,CAT、GSH-Px、T-SOD的活性和T-AOC的水平明显升高（P〈0.05）,MDA含量明显减少（P〈0.05）。结论GBE对6-OHDA诱导的PC12细胞氧化应激具有抑制作用,提高CAT、GSH-Px、T-SOD的活性和T-AOC的水平可能是其抗氧化作用的机制之一。     

银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞Bax和Bcl—2表达的影响

目的探讨银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract,GBE）对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OH—DA）诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制。方法经不同浓度GBE预处理体外培养的PC12细胞加入6-OHDA诱导多巴胺能神经元损伤模型,用4-甲基偶氮唑蓝（MTT）检测PC12细胞活力;流式细胞仪（FCM）测定PC12细胞凋亡百分比;采用免疫印迹法检测Bcl-2和Bax的表达水平。结果100μmolZL的6-OHDA处理PC12细胞24h,细胞活力较正常对照组明显降低（P〈0．01）;与模型组比较,GBE20,40μg/ml可明显减轻6-OHDA对PCI2细胞的毒性,GBE可使细胞活性增强,降低凋亡百分比。与正常对照组比较,模型组Bax表达升高,而Bcl-2表达降低（P〈0．05）。与模型组比较,GBE各剂量组Bax降低,而Bcl-2升高,且呈剂量依赖性（P〈0．05）。结论GBE对6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用,上调Bcl-2和下调Bax表达可能是其作用的机制之一。     

5-羟色胺2A受体基因A-1438G多态性与精神疾病患者自杀未遂的关系

近年来自杀的神经生物学研究集中在5-羟色胺2A(5-HT2A)受体基因的突变上。本研究探讨5-HT2A受体基因的多态性与精神疾病患者自杀未遂的关系，并随访3年，以期找出自杀的相关基因和遗传标志。     

自体骨髓间充质源神经干细胞移植应用于中枢神经系统疾病7例

背景:前期应用骨髓间充质源神经干细胞移植治疗模拟神经系统疾病动物实验模型取得较好效果.目的:观察应用自体骨髓间充质源神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的临床疗效.方法:2008-10/2009-04应用自体骨髓间充质源神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病患者7例.骨髓穿刺术抽取自体骨髓血50～60 mL,在体外经过分离培养后,制成骨髓间充质干细胞悬液,由患者自体脑脊液诱导定向分化为神经干细胞,通过腰椎穿刺术经蛛网膜下腔鞘内注射输注方式移植.观察患者移植前后神经功能缺损症状及移植后不良反应.结果与结论:经移植治疗后3例患者均未见不良反应.出院后随访6个月,7例患者神经功能缺损症状较移植前均有一定程度的改善.提示自体骨髓间充质源神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病所致的神经功能缺损疾病是一种安全、方便、有效的方法.     

非致残性缺血性脑血管事件病人氯吡格雷抵抗的临床相关因素分析

目的 探讨非致残性缺血性脑血管事件(NICE)病人氯吡格雷抵抗的临床相关因素.方法 连续收集2019年1―10月徐州医科大学附属医院神经内科收治的165例非致残性缺血性脑血管事件病人,并且给予阿司匹林联合氯吡格雷治疗,7～10 d后采用血栓弹力图检测其血小板抑制率.将二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚抑制率≤30％定义为氯吡格雷抵抗(CR).比较人口统计学、血管危险因素、实验室检查等临床资料,采用logistic多因素回归分析氯吡格雷抵抗的相关因素.结果 NICE病人,34例(20.6％)发生氯吡格雷抵抗.logistic模型分析显示,hs-CRP(OR1.143,95％CI:1.024～1.276;P=0.017)、PLR(OR1.014,95％CI:1.005～1.022;P=0.002)、Hcy(OR1.12795％CI:1.046～1.215;P=0.002)是氯吡格雷抵抗的独立相关因素.结论 hs-CRP、PLR、Hcy是非致残性缺血性脑血管事件病人氯吡格雷抵抗的独立相关因素.