双硫仑通过上调GADD45A抑制胰腺癌细胞增殖的机制研究

目的：通过体外实验评估双硫仑（disulfiram,DSF）对人胰腺癌细胞增殖、细胞周期的影响并初步探讨可能作用机制。方法：不同浓度梯度的DSF联合Cu（DSF/Cu）处理人胰腺癌PANC?1和PATU8988T细胞,CCK?8法检测细胞增殖活性及药物对细胞的增殖抑制率;选取IC50浓度的DSF/Cu处理细胞,流式细胞术检测细胞周期分布情况,并采用荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中生长阻滞和DNA损伤诱生基因45A（growth arrest and DNA damage inducible 45A,GADD45A）,G2/M周期特异性蛋白CCNB1、CDC25C、CDK1的转录和翻译水平,同时检测MAPK通路相关蛋白P38和JNK蛋白磷酸化水平;siRNA干扰试验检测抑制GADD45A基因后细胞相对活力、细胞周期及MAPK通路相关蛋白磷酸化水平的变化。结果：DSF联合Cu对人胰腺癌细胞增殖具有明显抑制作用,且抑制率随DSF浓度增加而增加。DSF/Cu可明显上调GADD45A基因的表达,诱导细胞周期G2/M期阻滞,抑制G2/M周期特异性基因及蛋白的表达;Real?time PCR结果表明DSF/Cu处理PANC?1细胞和PATU8988T 细胞24 h后GADD45A表达量升高,分别为对照组的11.4和7.99倍（P均<0.001）;相应地,PANC?1细胞和PATU8988T 细胞CCNB1、CDC25C、CDK1表达量下降,分别为对照组的31%、35%和37%（P均<0.05）及48%、24%和29%（P均<0.05）,差异有统计学意义。Western blot结果与RNA表达结果相对应,且呈浓度和时间依赖趋势。同时,MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平增高。siRNA?GADD45A干扰后细胞活力增加,G2/M细胞比例降低,MAPK信号通路磷酸化水平降低。结论：DSF/Cu可通过上调GADD45A并激活JNK/P38?MAPK信号通路诱导细胞周期G2/M阻滞,进而引起细胞增殖抑制,发挥抗肿瘤作用。