Therapeutic effect of 5-FC on YCD modified murine P388 leukemia in vivo

Cytosine deaminases (CDs) in bacteria andfungi are found to deaminate prodrug 5 - FC intocytotoxic agent 5 - FU .Yeast CD (YCD) is clonedfrom Saccharomyces cerevisiae.It has been shownpreviously that YCD was more efficient inconversing5 - FC than bacterial CD(b CD) [1-3 ] .As anovel suicide gene therapy system,YCD/ 5 - Fcsystem may be promising in cancer therapy andprevention of graft versus host disease.In thepresent study,we established a P388/ DBA murineleukemia model by infusin…     

酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用

目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)是新型自杀基因,利用重组逆转录病毒载体(RV),将YCD高效导入人原代T细胞,并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应。方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR,瞬时质粒共转染法制备RV,流动感染法或Retronectin 离心法感染人原代T细胞,嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR,检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能,在体外和SCID小鼠体内,探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等。结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106TU/mL。流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%,2轮离心 Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n=3)。经嘌呤霉素筛选48h获得T-YCD-puroR细胞,其基因阳性率96.7%±1.5%,并可大量扩增。与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义。体外实验显示,与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071mg/Lvs22.3mg/L),对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0μmoL/Lvs4.9μmoL/L)。T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠,7d后每只小鼠腹腔注射5μmoL的5-FC,连续7d,首次给药24h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45 细胞显著下降(P<0.01)。结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响,T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤。本研究为进一步研究打下了良好的基础。     

梅毒血清学RPR前带现象的纠正

梅毒血清学ＲＰＲ (快速血浆反应素环状卡片试验 )检查 ,试剂稳定 ,操作简便 ,结果易观察 ,己广泛应用于临床。但我们发现本法也存在着前带现象 ,使阳性结果错报成阴性 ,特做纠正试验报告如下。1　材料与方法　　标本来源为我院就诊病人 1例 ,经检验血清梅毒确正试验(ＴＰＨＡ)阳性 ,ＲＰＲ试验阴性。ＲＰＲ试剂盒购于上海荣盛生物技术有限公司。ＴＰＨＡ试剂盒为兰州生物制品研究所提供。将待检血清用生理盐水分别做 1∶2、1∶4、1∶8、1∶1 6、1∶32和 1∶64倍稀释 ,每个稀释度血清分别各取 0 0 5ｍｌ,加入卡片环中 ,观察结果。　　结果…     

沥青烟对大鼠外周血淋巴细胞微核、Heinz氏小体及雄性大鼠生殖细胞影响的研究

沥青烟对大鼠外周血淋巴细胞微核、Ｈｅｉｎｚ氏小体及雄性大鼠生殖细胞影响的研究甘肃白银公司劳研所温丽敏，郭忠毅，杨生蓉采用作业现场煤焦油沥青（ＣＴＰ）烟浓缩物２ｍｇ／只·天，１ｍｇ／只·天，０．２ｍｇ／只·天分别对大鼠经口染毒，６天／周，共染毒９５天，...     

新型自杀基因酿酒酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因修饰供者T淋巴细胞防治移植物抗宿主病体外研究

目的将新型自杀基因——酿酒酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)导入人T淋巴细胞,在体外证明YCD自杀基因体系的有效性,为自杀基因应用于体内防治移植物抗宿主病(GVHD)提供了理论基础。方法利用脂质体法转染包装细胞293T,分离、培养人外周血单个核细胞,病毒上清转染活化后的人T细胞,应用Pu-romycin筛选扩增,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测目的基因的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测细胞因子的分泌情况,噻唑蓝(MTT)法检测其对前体药物的敏感性。结果通过高速离心富集RV、CH-296包被+离心感染法等,对经高效扩增的人T淋巴细胞基因感染率可达38.2%。RT-PCR可检测到转基因T-YCD细胞中YCD基因的表达,筛选出的转基因T淋巴细胞的细胞因子分泌无显著变化。体外实验证实转基因T淋巴细胞可被前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)显著杀伤。结论利用pMSCV-YCD-Puro载体,可将YCD基因高效导入人T淋巴细胞,快速筛选出阳性细胞;转基因T淋巴细胞的细胞因子分泌功能未受显著影响,在体外证实导入YCD的转基因T淋巴细胞可被5-FC有效杀伤。     

批量快速测定法测定标志基因为GFP的重组病毒滴度

基因治疗若要走向临床 ,由于每批重组病毒间的差异可能很大 ,务必要建立一套简便实用的病毒滴度监控方法。而目前病毒 (尤其是逆转录病毒 )的滴度测定耗时费力 [1 ,2 ] ,或由于检测成本高而流于形式。我们建立了一套适合大批量、快速测定重组逆转录病毒 (RV )、腺病毒 (AV)等滴度的方法 ,现以增强型绿色荧光蛋白 (e GFP)标志基因为例 ,报告如下。1　材料和方法1.1　材料　 DMEM培养液 (Gibco BRL 公司 ) ;新生牛血清(NBS,杭州四季青公司 )。聚凝胺 (polybrene,Sigma公司 ) ;Fusion6转染试剂 (Roche公司 ) ;JS- 2病毒富集膜由南京…     

西司他丁钠+亚胺培南消除细胞培养中细菌污染的研究

目的 :研究西司他丁钠 +亚胺培南 (泰能 )清除细胞培养中细菌污染的可行性。 方法 :将 1 5批细胞培养中已发生细菌污染的细胞 ,用含泰能 1 0～ 1 0 0 μg/ ml的 PBS洗涤 3次 (PBS用量逐次递增 ) ,第 3次洗涤之前将细胞悬浮于含 1 0 0 μg/ m l泰能的完全培养液 1 .5 ml中 37℃孵育 30 min;然后细胞移入含 1 0 0 μg/ m l泰能的完全培养液中培养 ,更换含 1 0 0 μg/ ml泰能的完全培养液 1次 / d,共 3d。结果 :成功消除 1 4批细菌感染 ,另 1批加用万古霉素后亦获成功。结论 :泰能可以有效消除细胞培养中的细菌污染 ,其剂型和包装等尚可改进     

YCD基因修饰对小鼠P388白血病的体内治疗作用研究

目的：以P388/DBA小鼠白血病模型，探讨新型自杀基因YCD的体内治疗作用。方法：用逆转录病毒载体将YCD基因导入，筛选P388YCDeGFP细胞克隆，以P388eGFP和野生性（wt）P388细胞为对照。（1）3组细胞腹腔接种给DBA小鼠（n=5），5×106/只（下同），观察致病性；（2）3组细胞腹腔接种给DBA小鼠（n=5），分别以5FC治疗2周，观察疗效；（3）2组×5只小鼠腹腔接种P388YCDeGFP，5FC 5 μmol/L·d-1×2 d或PBS治疗，根据小鼠存活时间推算杀伤效率。以流式细胞仪、冰冻切片和HE切片检测各脏器中白血病细胞的分布和变化。结果：基因导入对细胞的生物学特性影响不显著；5FC治疗2周，YCD组小鼠存活(17.8±1.89) d，而eGFP组和wtP388组分别存活(7.8±1.10) d 和(7.7±1.15) d （P<005）；5FC治疗2 d的杀伤率达99.6%。结论：YCD转基因细胞在体内可被5FC有效杀灭，该系统具有应用前景。     

BsAb HER-2×CD3对过度表达HER-2乳腺癌细胞的细胞毒作用

目的 :研究应用抗HER 2抗原和CD3抗原的双向基因工程抗体BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对过度表达HER 2乳腺癌细胞的细胞毒作用。方法 :以过度表达HER 2的乳腺癌细胞株SK BR 3为靶细胞 ,T淋巴细胞为效应细胞 ,采用MTT法、3 H TdR掺入法测定BsAbHER 2×CD3对靶细胞、效应细胞的抑制作用及其介导的效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果 :BsAbHER 2×CD3具有MAbHER 2和MAbCD3的双重特性 ,既能抑制SK BR 3细胞生长 ,又可促进正常人外周血T淋巴细胞增殖。BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对靶细胞产生显著的细胞毒作用 ,明显强于MAbHER 2对靶细胞的作用 ,E∶T =2 0∶1为最佳效靶比。结论 :BsAbHER 2×CD3 ,既可以与HER 2过度表达的肿瘤细胞特异性结合 ,又可以介导T淋巴细胞对肿瘤细胞产生特异性杀伤作用 ,具有明显的抗肿瘤作用     

eGFP标记肿瘤细胞小鼠模型的建立与应用

目的〖HT5"SS〗： 以携带绿色荧光蛋白基因（eGFP）的重组逆转录病毒（RV）标记肿瘤细胞,建立小鼠体内长期、系统肿瘤细胞研究模型,并初步探讨其应用。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 制备高滴度eGFPRV,感染小鼠白血病P388细胞,有限稀释法获得eGFP＋的单细胞克隆;在体外和DBA/2小鼠体内,分别以流式细胞术、荧光倒置显微镜、冰冻切片和普通病理切片、半固体集落培养和PCR等方法,观察小鼠体内eGFP标记肿瘤细胞的效率、定位和时效。〖HT5W〗结果 〖HT5"SS〗： eGFP基因导入率达80.2%,经克隆筛选后eGFP＋率>99.2%。P388eGFP细胞体外传代3个月后eGFP＋率为95.2%,体内序贯接种(56.3±1.25)d后eGFP+率为(93.3±0.50)% (n=3)。eGFP基因导入未影响P388细胞的体内外生物学特性。多聚甲醛灌注固定法和液氮速冻法可有效保存组织中的荧光,灌注固定法制备的标本适用于多种病理和组化染色观察;外周血、肝、脾、脑等脏器中eGFP＋细胞的分布、增殖,可用流式细胞仪和荧光显微镜等动态、定量观察,并可通过外周血的荧光细胞变化动态观察肿瘤细胞对治疗的反应;无菌获得的eGFP＋细胞可用于体外培养或体内序贯移植;PCR等技术可提高微量肿瘤细胞检测的敏感性。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗： 成功建立的模型可在体内外以多种方法长期、动态、敏感地追踪观察荧光标记的肿瘤细胞,可广泛应用于肿瘤和细胞组织工程等领域。