离体消化法分离原代肝星状细胞

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离方法,提高肝星状细胞分离的纯度和活力.方法:本研究主要依据Weiskirchen的方法并加以改进,灌注后即将肝脏从原位分离,随之使用0.25%的链霉蛋白酶E和0.025%的胶原酶Ⅳ消化,经DNA酶Ⅰ分散,筛网过滤、离心,将细胞沉淀用18%Nycodenz密度梯度离心,获取肝星状细胞.台盼蓝染色鉴定细胞活率,Desmin免疫细胞化学染色法鉴定肝星状细胞纯度.结果:本方法所建立的离体消化分离肝星状细胞方法,每只大鼠肝约获取2.7×107个肝星状细胞,活率、纯度分别为99%、90%.该方法可有效减少细胞污染、提高细胞活力,值得广泛应用.结论:本文所建立的大鼠离体消化法分离肝星状细胞,方法简单可行,较大程度避免了细胞污染,提高了细胞的存活率和纯度.     

血管紧张素转化酶基因多态性与肝硬化发生的研究

目的 探讨ACE基因的多态性与肝硬化发生的关系。方法 比较193例肝硬化患者和219例健康人D／I基因型的分布情况，用PCR直接分型法检测ACE基因多态性。结果 219例健康对照中，DD型占21．0％，Ⅱ型占29.2％，DI型占49．8％。193例肝硬化患者中DD型占15.5％，Ⅱ型占38．3％，DI型占46.1％。两组间基因型分布差异无显著性。但肝硬化患者中Ⅰ等位基因频率显著高于健康对照（P〈0.05）。结论 等位基因可能与肝硬化发生有莱。     

丙型肝炎慢性化的影响因素

丙型肝炎(简称丙肝)是慢性肝病的主要病因之一,目前全世界约有1.7亿丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染者,而慢性丙肝易发展为肝硬化、甚至肝细胞癌。有关丙肝慢性化的机制涉及到病毒准种复杂度(quasispecies complexity)、病毒基因型、宿主因素以及信号转导异常等多个方面。     

注射用血栓通对实验性肝损伤的防治作用及其机制

目的 本研究旨在观察注射用血栓通对肝损伤的防治效果,并初步探讨其发挥药效的机制.方法 将0.6 mmol/L的H2O2加入到10-7～102μg/ml的经注射用血栓通预处理HepG2细胞中,四甲基偶氮唑盐(MTT)观察细胞活力;10% CCl4腹腔注射于经注射用血栓通(50 mg/kg、5 mg/kg、0.5 mg/kg)预处理的SD大鼠,于注射CCl4的24、48、72 h动态观察大鼠血清ALT、AST、TBil的变化,并于实验结束取大鼠肝组织进行组织学检查;HepG2细胞经10-3μg/ml注射用血栓通作用48 h,提取mRNA,逆转录成cDNA,与芯片杂交,根据基因芯片杂交信号强弱筛选相关基因.结果 注射用血栓通处理的HepG2细胞受到H2O2损伤时能够维持细胞的活力状态;注射用血栓通可以抑制CCl4造成肝损伤时血清ALT、AST、TBil的升高,并减轻肝损伤时大鼠肝组织的病理改变;注射用血栓通的肝细胞损伤保护作用可能与上调肝细胞损伤修复基因有关.结论 注射用血栓通能够抑制H2O2造成的肝细胞损伤,抑制CCl4造成的大鼠肝损伤,其机制可能与其上调某些损伤修复基因的表达及/或下调某些损伤相关基因表达有关.     

血管紧张素原基因T174M变异与肝硬化的相关性

目的:研究血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)基因T174M分子变异与肝硬化的关系.方法:提取正常人64例和肝硬化患者65例白细胞基因组DNA,通过PCR、限制性片段长度多态性和测序等技术,观察AGT基因型在肝硬化组和正常组分布的差异.结果:AGT基因T174M位点MT和TT基因型的频率在正常组和肝硬化组分别为82.8%、17.2%和84.6%、15.4%,两组之间不存在差异(χ~2=0.077,P>0.05).结论:血管紧张素原基因T174M变异与肝硬化没有显著关系.     

5-羟色胺在胆管上皮细胞与门管成纤维细胞自分泌／旁分泌中的作用

目的探讨5-羟色胺（5_hydmxytryptamine,5-HT）在胆管上皮细胞（biliary epithelia cells,BECs）与门管区成纤维细胞（portal fibroblasts,PFs）之间自分泌／旁分泌效应中的意义,阐述两种细胞之间的相互作用。方法体外细胞培养分为6组：1）BECs组单独培养;2）BECs＋TGF—β1组,BECs单独培养,用2ng／ml重组TGF—β1干预24h后更换培养液;3）BECs＋5-HT组,BECs单独培养,以60ng／ml的5-HT干预48h后更换培养液;4）PFs组单独培养;5）PFs＋5-HT组,PFs单独培养,以60ng／ml的5-HT干预48h后更换培养液;6）BECs＋PFs,共同培养。各组均在培养72h后,以酶联免疫吸附分析法（ELISA）检测培养介质内5-HT、TGF—β1含量;实时荧光定量多聚酶链反应（QRT—PCR）检测BECs内色氨酸羟化酶（TPHl、TPH2）和5-HT受体1A、1B表达;以BrdU、α—SMA分别作为BECs增殖及PFs转化为肌纤维母细胞（myofibroblasts,MFs）的标志,免疫细胞化学检测。结果单独培养的BECs表达5-HT合成限速酶TPH1、TPH2及5-HTRIA、5-HTR1B,5-HT分泌较高而BECs增殖不明显;经TGF—β1处理或与PFs共培养后,TPH1、TPH2表达各减少80％和87％,5-HTR1A、5-HTR1B表达分别减少75％和85％,BECs增殖明显。单独培养的PFs分泌TGF—β1,部分呈α—SMA阳性的MFs;经5-HT处理或与BECs共培养后,TGF—β1表达及MFs显著增加。结论BECs来源的5-HT以及PFs来源的TGF—β1介导BECs与PFs之间的自分泌与旁分泌效应,维持BECs增殖和PFs向MFs的转化,在胆管病发病机制中可能具有重要意义。     

抑制性消减杂交技术筛选γ-氨基丁酸调节的肝星状细胞系靶基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选γ-氨基丁酸(GABA)作用肝星状细胞系HSC-T6后的差异表达基因.方法:10 umol/L的GABA作用于HSC-T6细胞24 h,提取mRNA,用分光光度计进行定量分析.以GABA处理和未处理的T6细胞mRNA为模板逆转录合成双链cDNA(dscDNA),并分别标记为Tester和Drivet,酶切后与接头连接,经两次杂交,构建消减杂交文库,将消减文库的扩增产物进行转化、克隆分析后应用生物信息学技术将测得序列再进行同源性分析.结果:15种基因表达上调,其中包括与DNA合成、线粒体、肿瘤抑制以及凋亡相关的4类基因,结果显示GABA可能促进HSC-T6细胞增殖而抑制凋亡.结论:用SSH技术可以成功获得GABA刺激肝星状细胞基因上调的监测,证明GABA能够影响肝星状细胞的基因表达谱.     

河北省固安县某农村单采浆献血员丙型肝炎病毒感染的追踪研究

目的:了解我国输血后丙型肝炎病毒(HCV)感染的慢性化规律和影响因素.方法:对河北省固安县某农村137例单采浆献血员HCV感染12～25年的现状进行调查,包括临床表现,血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、碱性磷酸酶(ALP)、血清总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)测定和αFP检测,病毒学标志检测以及B型超声检查,其中,HCV RNA的测定采用荧光定量PCR方法,抗-HCV和HBsAg测定采用酶联免疫吸附试验.结果:该组HCV感染的慢性化率为70.99%,自然阴转率为29.01%.137例感染者目前几乎均无症状,总的ALT和/或AST异常率为37.40%,6例为中度,其余均为轻度,无重度.但B型超声检查发现,轻度者占57.72%,中度占38.21%,重度占4.07%.重度者距感染发生时间分别为13、14、21、25和25年.HCV RNA阳性组的ALT、AST和γ-GT平均水平显著高于阴性组,抗-HCV阳性组的ALT/AST的异常率显著高于阴性组,抗-HCV滴度与HCV RNA水平的对数呈正相关(r=0.747,P<0.01).男性感染者的慢性化率高于女性感染者(78.69%比64.29%).结论:本组输血后HCV感染自然阴转率较高,慢性HCV感染表现隐匿,肝酶学检查指标大多轻到中度异常,不能充分反映疾病的严重度,B型超声检查在判断疾病发展中有重要作用.12～25年后的肝硬化发生率约为4.07%.男性感染者的慢性化率高于女性.     

血管紧张素原基因5′端核心启动子区(-6)A～G变异与肝硬化相关性

血管紧张素原(AGT)主要在肝脏合成,是肾素-血管紧张素系统的惟一初始底物。AGT基因核心启动子区域位于TATA框与转录起始位点之间,对AGT基因转录表达起重要调空作用。AGT基因转录起始位点上游(-6)位点存在A～G突变,该突变可以直接影响AGT基因基础转录速率。研