淡色库蚊抗药性相关基因--NYD-MLC2基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关基因NYD-MLC2的cDNA全长序列并鉴定其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因片段序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增NYD-MLC2基因3′、5′端,经对位拼接获得全长序列,并进行生物信息学分析;荧光定量PCR验证此基因在抗性和敏感品系的表达差异。结果:获得淡色库蚊NYD-MLC2cDNA全长序列,开放阅读框为630bp(GenBank/NCBIDQ140391),编码210个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-MLC2与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)一个未知功能的蛋白同源性最高,为91%;实时荧光定量PCR结果显示,NYD-MLC2在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的4.08倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因cDNA全长序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-MLC2与淡色库蚊溴氰菊酯抗药性相关,值得进一步研究。     

淡色库蚊抗性相关基因--NYD-GBE基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因cDNA全长序列并验证其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗性相关NYD-GBE基因片段设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增糖原分支酶基因5′、3′端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行生物信息学分析。结果:获得淡色库蚊NYD-GBEcDNA全长序列,开放阅读框为2070bp(GeneBank/NCBIDQ102393),编码689个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-GBE与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)和拟暗果蝇(Drosophilapseudoobscura)一个未知功能的蛋白同源性最高,为82%和72%,与人糖原分支酶的基因同源性次之为60%。荧光定量PCR结果显示,NYD-GBE在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的19.7倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因全长cDNA序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-GBE与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,值得进一步研究。     

蚊抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系的建立与表达鉴定

目的 建立抗药性相关糜蛋白酶基因稳定转染细胞系。方法 采用PCR方法，以淡色库蚊抗药性品系CD-NA文库为模板，扩增出抗药性品系高表达的糜蛋白酶基因编码区；经T／A克隆测序鉴定后，亚克隆到真核表达载体piEl-3，构建重组昆虫细胞表达载体piEl-3／chy，经酶切和PCR鉴定后，与带有筛选标记的piEl-neo质粒共转染蚊细胞C6／36，通过G418选择培养，建立转染细胞系；用RT-PCR、Westernblotting鉴定糜蛋白酶基因的转录表达。结果 成功构建了真核表达载体piE1-3／chy，证明糜蛋白酶基因已转入C6／36细胞，建立了稳定转染细胞系，表达产物分子质量单位约30ku，与理论值相符。结论 稳定转染细胞系的建立和基因表达为进一步研究糜蛋白酶基因与抗药性的关系奠定了基础。     

对溴氰菊酯抗性和敏感淡色库蚊不同发育阶段的抗生水平

对室内选育的淡色库蚊用浸渍法测定了Ⅱ龄，Ⅲ龄和Ⅳ龄和幼虫，用接触筒法了早期，中期和晚期成虫。并观察了增效醚，磷酸三苯酯和杀虫脒与溴氰菊酯混用后的增效效果。结果表明：１．淡色库蚊各发育阶段对溴氰菊酯的抗性水平，在敏感品系由高至低依次为中期，晚期，早期成虫，Ⅳ龄，Ⅲ龄和Ⅱ龄幼龄，在抗性品系为早期，中期，晚期成虫，Ⅳ龄，Ⅲ龄和Ⅱ龄幼。２．ＰＢ和杀虫脒均有明显增效作用，提示抗性可能与氧化代谢增强和靶标部位     

淡色库蚊抗溴氰菊酯品系CYP4E2r6基因的克隆与生物信息学分析

目的 从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫扩增并分析CYP4E2r6基因，为蚊虫抗药性的研究、检测和防治筛选靶标。方法 根据已扩增的CYP4E2r6基因片段（长470bp，GenBank登录号为CB074945）的序列设计2条特异引物，从淡色库蚊抗溴氰菊酯品系Ⅳ龄幼虫提取RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，用5’-RACE和3＇-RACE方法，各获得722bp、617bp片段。进行序列拼接并对所得新基因进行登录和生物信息学分析。结果获得了1条3’端含polyA尾，长1025bp的CYP4E2r6基因大片段（GenBank登录号为AY309972），编码289个氨基酸，与果蝇细胞色素P450氨基酸的同源性为55％。编码蛋白的理论分子质量单位为32．9ku，等电点为5．8。结论 获得了CYP4E2r6基因大片段，为进一步获取全长基因并研究该基因的功能奠定了基础。     

杀虫剂的酶促降解及其研究进展

杀虫剂被广泛使用以来,对生态环境的污染、食物中的农药残留等问题引起人们日益关注,研究杀虫剂的酶促降解将为解决杀虫剂污染及残留提供新的途径,本文对常见几类杀虫剂的酶促降解及其研究进展予以综述。     

用0.1mm超薄凝胶做等电聚焦电泳

等电聚焦电泳是一种有高分辨率的分析技术。用1mm厚度的聚丙烯酰胺凝胶做支持物,通常每一加样片的加样量为15μl,根据染色敏感性,蛋白浓度一般为1～15mg/ml。用考马斯亮蓝染色的最适蛋白量是每一轨道20μg。低于此量难以得到理想结果。在实际应用中有时会遇到蛋白浓度较     

用抑制性差减杂交法和基因芯片鉴定蚊虫抗药性和敏感性相关基因

由于杀虫剂的广泛、大量和长期使用 ,媒介昆虫对杀虫剂逐步产生了抗药性 (抗性 )。对媒介昆虫抗性的分子机理研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。抗药性和 (或 )敏感性相关基因的分离将为抗性分子机理的深入研究打下基础。近年来 ,国外研究者采用经典的“功能克隆法”克隆到一些抗药性相关基因。然而 ,在事先无目的蛋白或其相应基因定位的情况下分离这些基因是相当困难的。最近建立的抑制性差减杂交法 ( suppression subtractive hybridization,SSH )这一“表型克隆”新策略 ,无需事先知道起作用基因的背景资料 ,仅凭表型直接分离基…     

当涂山区钉螺生殖力和血吸虫易感性的实验研究

有钉螺孳生而无血吸虫病病人发现的现象存在于我国血吸虫病流行区的局部地方。各地曾分别从血吸虫虫株、传染源和有螺环境等方面探索了这个问题。本研究于1983年4～10月对长期有钉螺孳生而未发现病人的安徽省当涂县丹阳公社山区作了流行病学调查;在实验室内对当涂丹阳山区钉螺(简称当涂钉螺)进行了生殖力和血吸虫易感性观察,并用本所饲养的安徽省安庆地区的江滩阴性钉螺作对照(简称对照钉螺),对当涂钉螺和血吸虫病流行的关系进行了探讨。     

RNAi技术及其在寄生虫相关基因功能研究上的应用

RNAi是近几年发展起来的抑制基因表达的新技术。它通过dsRNA介导的特异性降解相应序列的mRNA ,从而导致转录后的基因沉默。目前已在线虫、果蝇、锥虫、真菌、小鼠及植物等生物中建立RNAi技术。其可以作为一种简单有效的代替基因敲除的分子遗传的研究工具 ,在后基因组时代寄生虫的基因功能研究和药物开发中具有广阔的前景