心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅵ．一种新的体内基因转移方法

将医用缝合线浸泡在质粒ＤＮＡ溶液中，然后缝合在大鼠股四头肌上，可以观察到外源基因在肌肉组织中高效、稳定地表达，其表达量高于磷酸钙共沉淀和ＤＮＡ沉淀块埋植法，较肌肉直接注射法表达量高１０倍左右。     

大鼠心肌缺血的血管内皮生长因子基因治疗

目的：应用血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）基因治疗心肌缺血,方法：雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠２０只,结扎冠状动脉前降支造成心肌梗死模型。心脏多点注射构建的ｐｃＤ２／ＶＥＧＦ真核表达质粒。应用逆转录聚合酶链反应,ＶＥＧＦ免疫组织化学染色,心肌碱性磷酸酶染色及血管计数等方法检测了ＶＥＧＦ基因在缺血心肌中的表达及生物学作用。     

制备性SDS—PAGE纯化大肠杆菌表达的重组人VEGF

在以基因工程方法实现大肠杆菌表达外源重组人ＶＥＧＦ的基础上，应用制备性ＳＤＳ—ＰＡＧＥ从包含体中分离纯化了这一因子。纯化蛋白在含有氧化型与还原型谷胱甘肽和肝素的缓冲液中复性，复性后的ＶＥＧＦ蛋白成为同源双体，经Ｍｉｌｅｓ方法检测，证明可提高血管通透性，具有生物活性。这一研究为制备具有生理与病理意义的研究奠定了基础。     

线粒体融合蛋白Mfn2对心肌细胞肥大的抑制作用

目的:探讨线粒体融合蛋8-2(mitofusin 2,Mfn2)在心肌细胞肥大时表达的变化,及其对心肌细胞肥大的作用.方法:原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞用苯肾上腺素(phenylephrine,PE)10^-5moL/L处理,诱导心肌细胞肥大模型.采用RT-PCR和Western blot方法检测Mfn2基因在肥大心肌细胞中的表达.培养的心肌细胞感染含有Mfn2基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad Mfn2)或对照腺病毒Ad GFP后,给予PE刺激诱导心肌细胞肥大,采用3H-亮氨酸掺人法等方法评价过表达Mfn2对心肌肥大的影响.为了便于显示和分析,本研究将对照组的数据设为1,其他各组数据均为与对照组相比得到的相对数.结果:在PE诱导引起的肥大的心肌细胞中,细胞表面积增加约1倍(P<0.01),与不加刺激的对照组相比,心房利钠因子(atrial natriuretic fact,ANF)表达量也增加了约1倍(P<0.01),而Mfn2的mRNA水平(P<0.01)和蛋白质水平(P<0.01)均明显下降,分别为对照组的50%左右.AdMfn2转染后可检测到心肌细胞中Mfn2的过表达,与对照组Ad GFP(1.72±0.12vs2.47±0.06,P<0.05)相比过表达Mfn2能明显抑制PE引起的心肌细胞蛋白质合成量增加(0.98±0.10vs2.47±0.06,P<0.01)以及心肌细胞面积增大(1.530±0.008vs0.830±0.009,P<0.01).结论:在PE诱导的心肌细胞肥大模型中,Mfn2的基因水平与Mfn2蛋白水平表达明显降低,过表达Mfn2能抑制PE所引起的新牛大鼠心肌细胞蛋白质合成增加和心肌细胞表面积的增大.因此,Mfn2可能是参与心肌细胞肥大过程中的一个重要分子.     

骨髓间充质干细胞对持续缺氧心肌保护作用的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）保护持续缺氧心肌的作用及可能机制。方法体外培养成年大鼠MSCs和乳鼠心肌细胞,在培养的乳鼠心肌细胞加入MSCs或其条件培养液,在无氧（95%N2＋5%CO2）条件下共培养24、48和72h,采用Hoechst33258染色细胞核,计算凋亡细胞百分率;采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的变化。结果缺氧可以诱导心肌细胞凋亡,培养24、48和72h凋亡率分别为（26.5&#177;6.1）%,（20.2&#177;6.4）%和（51.6&#177;2.4）%,与MSCs共培养,心肌细胞凋亡率显著减低,分别为（7.3&#177;4.7）%,（4.3&#177;2.4）%和（15.1&#177;5.4）%（P〈0.05）;与其条件培养液共培养24和48h,心肌细胞凋亡率与对照组比较无明显降低,分别为（23.9&#177;4.1）%和（20.7&#177;2.5）%（P〉0.05）,共培养72h,心肌细胞凋亡率为（24.2&#177;4.2）%（P〈0.05）,显著低于对照组。蛋白质免疫印迹显示凋亡时心肌表达Bax水平较高,与MSCs或其条件培养液共培养72h后,Bax表达水平呈不同程度降低,与心肌细胞凋亡发生率减低一致,Bcl-2无明显变化。结论MSCs在体外对持续缺氧心肌细胞具有一定程度的抗凋亡作用,其机制可能通过细胞间直接接触和旁分泌细胞因子,影响Bcl-2家族部分蛋白在心肌细胞的表达。     

外源性标记基因LacZ在大鼠血管平滑肌细胞中的表达

外源性标记基因ＬａｃＺ在大鼠血管平滑肌细胞中的表达朱小君，胡征，毕万里北京医科大学心血管基础研究所唐朝枢，周爱儒，汤健本实验将标记基因ＬａｃＺ导入血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ），以观察外源基因在血管平滑肌细胞内的表达情况。材料和方法带有金属硫蛋白启动子（...     

p53抑癌基因在血管平滑肌细胞增殖和内皮剥脱再狭窄形成中的作用

ｐ５３抑癌基因在血管平滑肌细胞增殖和内皮剥脱再狭窄形成中的作用董薇，朱小君，刘勃，邱京欣北京医科大学心血管基础研究所付爱华，李岱宗，周爱儒癌基因和抗癌基因在细胞增殖和分化中具有重要作用。我们曾经提出癌基因表达过盛或抗癌基因表达不足可能是细胞增殖的重要...     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅰ．重组质粒pN2－LacZ在体外的表达

构建了带有标记基因ＬａｃＺ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＬａｃＺ。用磷酸钙共沉淀的方法，将ｐＮ２－ＬａｃＺ转染培养的大鼠血管平滑肌细胞，Ｇ４１８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，ＬａｃＺ基因已整合到细胞染色体上并转录出相应的ｍＲＮＡ。组化染色和酶活力测定结果表明，外源基因ＬａｃＺ可在血管平滑肌细胞中表达出有活性的蛋白质产物。提示，血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的靶细胞。