基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能方法的建立

目的建立一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞(NSCs)相关基因功能的方法。方法 RT-PCR检测鸡胚发育不同时期脊髓NSCs表面标志物;在鸡胚胚龄(E)E2.5~E3时,利用活体电转基因技术将p CAGGSGFP质粒转染到鸡胚脊髓,E6时体视荧光显微镜下筛选绿色荧光蛋白(GFP)阳性胚胎,每组至少取材5个;通过脊髓横切及open-book技术观察神经纤维投射情况;普通光学显微镜下剥离出3~5条脊髓,经胰蛋白酶消化、离心后,无血清NSCs培养基重悬获得细胞铺板,于37℃、5%CO_2细胞培养箱内培养,定时观察GFP阳性脊髓NSCs的形态变化。结果 RT-PCR结果表明,鸡胚脊髓中阳性表达NSCs表面标志物;随后的脊髓横切及open-book结果表明,GFP阳性转染侧的神经纤维能穿过底板,投射到脊髓对侧;而脊髓NSCs体外培养结果显示,GFP标记的脊髓细胞具有典型的NSCs形态,继续培养后有明显突起产生。结论本实验成功建立了一种基于鸡胚电转技术研究脊髓神经干细胞相关基因功能的方法。     

双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射研究方法的建立

目的建立1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的实验方法。方法鸡胚孵育至胚龄2.5~3d,通过鸡胚活体原位电转基因技术将携带有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒(p CAGGS-GFP)准确注射到鸡胚脊髓腔,实现定时、定位活体电转基因。转染后继续孵育至6d,取GFP阳性表达的胚胎,部分做脊髓横向切片,部分利用open-book技术将脊髓展开观察连合纤维的发育情况,每组至少取3个标本。其后在脊髓非转染侧连合神经元所在之处,点状注射Di I乙醇溶液,封片后于4℃避光孵育3d,在荧光显微镜下观察脊髓连合纤维投射情况。结果脊髓横切及open-book结果显示,鸡胚脊髓GFP阳性转染侧的神经元轴突穿过底板投射到脊髓对侧;同时在open-book结果中还可观察到,转染侧轴突穿过底板后分别沿腹索和外侧索向头尾部投射;Di I标记的非转染侧连合神经元轴突也同样穿过底板投射到对侧,并在侧索白质内延伸。结论本实验成功建立了1种双色荧光示踪鸡胚脊髓两侧连合纤维投射的研究方法,为研究脊髓神经发育提供技术保障。     

不同Reelin基因型小鼠海马结构组织学差异

目的通过对不同Reelin基因型小鼠海马区组织学结构的比较分析,为Reelin在海马结构形成中的作用提供依据。方法选择杂合子Reelin小鼠繁殖后代,在出生后10d进行基因型鉴定,设Reelin+/+、Reelin+/-和Reelin~-/-3组,每组3只小鼠。鉴定后的小鼠通过4%多聚甲醛心脏灌注后剥离全脑,通过多聚甲醛固定、蔗糖脱水后冷冻切片,采用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)为细胞核染色,用免疫荧光标记T-box brain gene 1(Tbr-1)、神经元核抗原(Neu N)和GFAP特异性表达的细胞,光学显微镜下观察、摄片后对结果进行分析。结果从DAPI染色的细胞核及Tbr-1、Neu N和GFAP标记的细胞结构可以看出,Reelin+/+型小鼠和Reelin+/-型小鼠海马区都具有相似的结构,但将Reelin+/+和Reelin~-/-型小鼠相比较,Reelin~-/-型小鼠海马结构模糊,齿状回细胞向门区扩散,海马本部的细胞层结构紊乱,出现密集双细胞带,GFAP标记细胞减少。结论 Reelin缺失表达对小鼠大脑正常结构的形成具有明显的影响。在Reelin表达缺失后海马区齿状回细胞分布弥散,海马本部细胞层的分布紊乱,胶质细胞及纤维分布减少。     

限制性液体复苏疗法在消化道出血中临床运用的探讨

目的 探讨限制性液体复苏疗法在消化道出血中的临床运用情况. 方法 对120例消化道出血患者随机分为(常规液体组)和(限制液体组)加以对比分析. 结果 通过临床实践证明,常规组入院后病死率22.18%,限制组入院后病死率为8.98 %,两组比较差异有高度显著性(P＜0.01或0.05). 结论 限制性液体复苏可维持重要器官的灌注,降低病死率,改善预后.     

对甲亢性周期性瘫痪18例患者的临床治疗体会

目的探讨以周期性瘫痪（periodic parchysis）为主要临床表现的TPP患者的治疗及相关发病因素，并加以分析。方法对18例TPP患者的临床治疗进行回顾分析，检测血中甲状腺游离激素Fr4、F33、TSH，血清钾和血清肌酶的变化情况。结果18例患者均有FT4↑、FT3↑，TSH↓，血钾偏低，有14例患者肌酸激酶、肌酸激酶同工酶升高，12例患者天门冬氨酸转氨酶升高。结论对TPP患者的重要临床观察指标为血中游离甲状腺激素FT4、FT3、TSH，血清钾和血清肌酶的检测，及时控制甲亢和维持血钾正常是治疗关键。     

#br# 鸡源Wnt3a融合蛋白表达载体的构建及其对鸡胚脊髓神经前体细胞增殖和轴突形成的影响

目的 构建鸡源Wnt3a 融合蛋白真核表达载体 (pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP),并探讨其在鸡胚脊髓发育过程中超表达后对神经前体细胞增殖及轴突形成的影响。 方法 利用分子生物学手段,提取鸡胚脊髓总RNA并获得Wnt3a片段,将其克隆到pCAG-MCs-EGFP载体中构建pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体。在鸡胚发育至2.5～3d (E2.5～E3) 时,利用鸡胚活体电转技术将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP（实验组）和pCAG-MCs-EGFP（对照组）质粒分别转入鸡胚脊髓,E4时取材切片,每组5个胚胎组织,采用免疫荧光染色技术检测Wnt3a和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达变化分析Wnt3a与细胞增殖间的关系,根据载体自发绿色荧光蛋白（GFP）观察脊髓神经前体细胞轴突生成情况。 结果 pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP表达载体基因测序结果与Gene bank中基因序列一致,将pCAG-MCs-Wnt3a-EGFP导入鸡胚脊髓中发现绿色荧光。在脊髓组织切片水平上,免疫荧光染色结果表明,Wnt3a在鸡胚脊髓中能够超表达。Wnt3a超表达后,与对照组比较,含有轴突的神经元数量明显减少(n=3, P<0.01),而PCNA 的表达量显著增加(n=3, P<0.01)。 结论 成功构建了鸡源性Wnt3a 融合蛋白真核表达载体,并证实Wnt3a在鸡胚发育过程中促进神经前体细胞的增殖并抑制轴突的形成。     

不同reelin基因型小鼠大脑皮层分布的差异

目的:比较分析不同reelin基因型小鼠大脑皮层分布的差异,为reelin在小鼠大脑皮层形成过程中的作用研究提供依据;方法:选择reelin杂合子小鼠繁殖后代,在出生10d时进行基因型鉴定,设reelin~(+/+)、reelin~(+/-)和reelin~(-/-)3组。每组取3只小鼠,采用DAPI染色细胞核,用荧光免疫组化标记FoxP-1、Tbr-1、NeuN和GFAP特异性表达的细胞,显微镜下观察拍照后进行结果分析;结果:从DAPI染色的细胞核及FoxP1、Tbr1、NeuN和GFAP标记的细胞显示,3种不同基因型小鼠大脑皮层结构彼此都存在一定差异,reelin~(+/-)型与reelin~(+/+)型小鼠相比大脑皮层结构相似,但也存在一定差异,如被FoxP-1和Tbr-1标记的神经元在SVZ区reelin~(+/-)型比reelin~(+/+)型更多;但reelin~(-/-)型与reelin~(+/+)型小鼠相比,reelin~(-/-)型小鼠大脑皮层无明显层的结构,FoxP-1、Tbr-1、NeuN和GFAP标记的细胞分布在整个皮层;结论:Reelin表达的下调或缺失对小鼠大脑皮层正常结构的形成存在影响,在reelin缺失表达后小鼠大脑皮层的形成明显发生异常,不具有典型的分层结构。     

139例脑桥梗死患者的临床分析

目的 根据脑桥梗死患者的症状、体征,结合脑桥的解剖学特点和头颅MRI检查对患者病灶定位,随之探讨脑桥梗死与椎基底动脉病变的相关关系.方法 连续入选2003年6月～2007年12月收住益阳医专附属医院神经内科的急性脑桥梗死患者139例,所有患者均行头颅MRI检查,将病例分为A(腹内侧梗死组--脑桥旁中央动脉分布区)、B(腹外侧梗死组-脑桥短旋动脉分布区)、C(被盖部梗死组-脑桥长旋动脉分布区)、D(混合组-可能累及A、B、C多条动脉分布区),并对其病灶位置分布、神经系统体征、神经功能缺损程度 (改良Rankin评分)等指标进行分析.结果 139例患者中A、B、C、D组各占66(47.5%)、44(31.6%)、17(12.2%)、12(8.7%).在临床表现特点上,腹内、外侧梗死多,表现为病灶对侧肢体偏瘫、中枢性面瘫以及构音障碍,同时伴或不伴肢体共济失调;脑桥被盖部梗死主要表现为脑神经瘫痪及感觉障碍;双侧脑桥梗死则往往表现为假性延髓性麻痹、双侧肢体运动障碍.结论 脑桥梗死病灶多位于腹内、外侧,且多表现为病灶对侧肢体瘫痪、中枢性面瘫以及构音障碍;不同梗死部位影响神经功能缺失程度不同,不同部位的梗死与椎基底动脉的狭窄或闭塞关系密切.     

小鼠神经母细胞瘤细胞中神经型钙黏蛋白超表达对突起形成及连环蛋白表达的影响

目的 探讨神经型钙黏蛋白（N-cadherin）调控连环蛋白（catenin）对小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）形态的影响。 方法 构建鼠源的N-cadherin融合蛋白超表达载体,利用脂质体转染的方法将空载体pCAG-MCS-EGFP和超表达载体pCAG-N-Cad-EGFP分别转染至N2a细胞,作为对照组和实验组;细胞划痕和黏附实验检测N-cadherin超表达对N2a细胞迁移和黏附的影响,免疫荧光检测N-cadherin超表达对N2a细胞形态的影响,并结合Western blotting检测连环蛋白家族的表达情况。 结果 与对照组相比,N-cadherin超表达促进细胞突起的形成,使得N2a细胞突起增多和伸长;N-cadherin超表达增强了黏附性而抑制了细胞的迁移能力;N-cadherin超表达使得细胞内连环蛋白家族中α-catenin、β-catenin和p120蛋白表达均显著上升（P<0.05）,而γ-catenin表达下降但差异不显著（P>0.05）;另外,N-cadherin超表达的细胞有明显的聚集现象。 结论 N-cadherin超表达促进N2a细胞突起形成,增强细胞的黏附性从而抑制细胞的迁移能力,调控连环蛋白家族成员的表达并促使细胞聚集。