b型流感嗜血杆菌D蛋白原核可溶性表达研究

目的 通过原核表达系统可溶性表达重组D蛋白,为多糖结合疫苗的制备提供蛋白载体.方法 将Hib CMCC株基因组DNA中去除信号肽的hpd基因片段插入pET43.1a表达质粒,转化入感受态大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白,经过硫酸铵沉淀和DEAE阴离子交换柱层析纯化后,用Western Blot的方法鉴定其免疫反应原性.结果 表达的重组蛋白以可溶性形式存在,表达量约占菌株总蛋白的44％,经过初步纯化后的重组蛋白可以和Hib抗血清发生特异性反应.结论 成功构建了D蛋白重组表达质粒,并在原核细胞中以可溶性形式表达出具有良好免疫反应原性的D蛋白.     

流感病毒在不同细胞中适宜培养条件的研究

目的 探索流感病毒在细胞中培养的适宜条件.方法 采用MEK细胞、FRhK-4细胞、MDCK细胞分别接种甲型流感病毒H1N1型、H3N2型和乙型流感病毒疫苗毒株,观察3种毒株在不同培养条件下的细胞病变、血凝滴度.结果 3株流感病毒接种细胞在33℃培养72 h后出现拉网、圆缩、脱落等现象;FRhK-4细胞和MDCK细胞对流感病毒较敏感.胞龄为48 h的细胞,在NaHCO3的终浓度为1.4%o,TPCK-胰酶浓度为1.0μg/ml的病毒维持液培养流感病毒为最适条件.结论 寻找到了细胞流感病毒的适宜条件.     

新工艺制备Hib结合疫苗原液长期稳定性试验

目的在前期开发的b型流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae type b,Hib)荚膜多糖提取新工艺及利用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化的疫苗制备新方法的基础上,评价利用新方法生产的Hib结合疫苗原液的稳定性。方法将疫苗原液在2～8℃条件下放置36个月,根据实验设计,不同时间取样并按照《中国药典》中相应的检测指标、检测方法进行评价。结果新工艺制备的Hib结合疫苗原液在2～8℃储存条件下,大部分指标保持相对稳定,只有分子量大小、高分子结合物含量及效力结果下降,但保存30个月仍符合2010年《中国药典》的相关要求。结论新方法与传统方法生产的Hib结合疫苗原液稳定性基本相同,证明了利用新方法制备Hib结合疫苗的新工艺可以用于扩大生产规模。     

巢式RT-PCR检测甲肝疫苗的感染性滴度研究

目的 建立一种快速灵敏特异的检测甲肝疫苗滴度的巢式RT-PCR检测方法。方法 运用巢式RT-PCR法对甲肝疫苗病毒滴度进行检测，并与细胞培养ELISA检测法进行比较。结果 巢式RT-PCR灵敏度和特异性均与细胞培养ELISA检测法相似。结论 巢式RT-PCR是一种简便、快速、灵敏的甲肝病毒检测方法，用于疫苗的常规检测有较好前景。     

抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原单克隆抗体的研制

目的应用杂交瘤技术制备抗脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的单克隆抗体。方法用脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原免疫雌性Balbc小鼠,取其致敏脾脏淋巴细胞与SP20小鼠骨髓瘤细胞融合。间接ELISA法筛选阳性克隆,制备腹水。检测McAb效价、抗体亚类和杂交瘤细胞核型。结果获得4株阳性杂瘤细胞株,选择一株制备腹水,ELISA效价为1∶2.4×106,中和试验效价1∶1.3×104,蛋白浓度为27.2mgmL。McAb与Ⅱ型Sabin株C抗原(ⅡC)、Ⅰ型Sabin株及Ⅲ型Phizer株D抗原(ⅠD、ⅢD)不发生交叉反应,具有高度特异性。结论成功的制备了针对脊髓灰质炎病毒Ⅱ型Sabin株D抗原的McAb,为进一步研究IPV效力检测奠定了基础。     

流感病毒裂解方法优化研究

目的研究流感病毒的裂解剂及裂解灭活条件。方法使用两种裂解剂TritonX100和TritonN101以不同浓度对流感病毒单价纯化液作用,通过电镜进行裂解效果观察,确定最佳裂解时间,用单向免疫扩散法检测HA含量作为评价指标。同时,观察先灭活再裂解和先裂解再灭活对病毒裂解效果的影响。结果TritonX100的裂解效果较优越,0.5%~1%TritonX100作用90min可使流感病毒裂解完全;TritonX100与甲醛作用的先后顺序对病毒的裂解灭活效果影响不大。结论0.5%~1%TritonX100可得到流感病毒的最佳效果。     

狂犬病毒疫苗新研究

狂犬病是由狂犬病毒引起的世界性人兽共患疾病,几乎遍及世界各个国家和地区.它的传播途径主要为咬伤,一旦临床症状出现,病人则无可挽救地死亡,自然条件免疫群永远不会建立.目前尚无有效的治疗方法,其控制主要依赖于疫苗的接种即是一种建立免疫群的方法.随着分子生物学研究的飞速发展,狂犬病毒分子生物学方面亦取得了显著进展.这对于研究狂犬病毒的基因工程疫苗具有重要指导意义.     

通过CDAP活化多糖制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-D蛋白疫苗初探

目的 用CDAP活化b型流感嗜血杆菌（Hib）荚膜多糖,制备b型流感嗜血杆菌荚膜多糖及D蛋白疫苗.方法 采用CDAP法在不同pH值条件下活化Hib荚膜多糖,再通过乙二酰肼（ADH）与D蛋白共价结合,制备Hib荚膜多糖与其D蛋白结合物原液,并对三批结合物原液的各项指标进行检测.获得的结合物原液免疫BALB/c小鼠,应用ELISA法检测血清中的IgG抗体水平,评价其免疫原性.结果 三批结合物原液以上检测指标均符合药典要求,衍生物中ADH含量对结合物的免疫原性有重要影响.结论 用CDAP活化工艺制备的Hib荚膜多糖-D蛋白结合物适宜制备结合疫苗,为以D蛋白为载体的Hib结合疫苗的制备及五价联苗的研制奠定实验基础.     

流感疫苗研究概况

流行性感冒(influenza)是由流感病毒引起的一种人、禽、畜共患的急性呼吸道传染病.流感能在短期内突然发生,迅速蔓延,造成不同程度的流行,在世界范围内引起人畜的发病和死亡.历史上,流感曾多次爆发:1918年"西班牙流感(H1N1型)",1957年"亚洲流感(H2N2型)",1968年"香港流感(H3N2型)"以及1977年"俄罗斯流感(H1N1型)"使许多人丧失了生命[1].     

H3N2流感病毒冷适应株的无血清培养

目的：探索无血清培养H3N2流感病毒冷适应株的适宜条件。方法以无血清适应的Vero细胞为介质,对流感病毒冷适应株（H3N2）的培养条件进行优化,以得到较优的基础培养基、pH值、TPCK胰酶添加量及其补加时间、病毒接种量和病毒收获时间。结果 H3N2流感病毒冷适应株能够感染无血清适应的Vero细胞;经过优化,病毒培养液适宜pH为7．15～7．64, BSA和TPCK胰酶添加量均为0．8～1．2μg／ml,细胞培养36h接种病毒,接种量MOI为0．05～0．10,于25℃培养168h收获时病毒效价达最高。结论优化了H3 N2流感病毒冷适应株无血清培养的适宜条件。