小鼠超高硫角蛋白基因启动子的克隆及其表达活性分析

目的 筛选在小鼠毛囊中具有高表达活性的内源启动子,为建立小鼠被毛特异表达外源蛋白的转基因技术奠定基础.方法 以小鼠基因组为模板,克隆得到超高硫角蛋白基因启动子超高硫角蛋白(UHS),将其分别与pβgal-Basic和pAcGFP1-N1载体连接,构建了重组真核表达载体.采用阳离子脂质体法转染胎鼠组织块,分析其表达活性.结果 转染后48 h,在蓝光激发条件下可以检测到绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠毛囊区高表达,转染96 h后,表达减弱;此外,转染后48 h,βgal染色结果显示在皮肤块的毛囊区存在蓝色点状区域.结论 UHS启动子在小鼠毛囊中具有表达特异性.     

孕马血清促性腺激素对幼龄鼠卵巢和子宫发育的影响

目的 探明孕马血清促性腺激素(PMSG)调控哺乳动物生殖生理机制.方法 用4 IU PMSG分别处理出生第5天、第10天、第15天和第21天幼鼠,观察其对卵巢和子宫发育的影响.结果 (1)PMSG处理后,出生第15天幼鼠的卵巢指数(33.08%)与对照组(27.16%)间差异显著(P<0.05);(2)PMSG处理后,第5天、10天和第15天幼鼠的初级卵泡和有腔卵泡相对数量与对照相比无差异,而21 d处理组次级卵泡相对数量显著增加;(3)虽然出生后10 d前的幼鼠子宫对PMSG的反应较弱,但是,PMSG对出生后15～21 d幼鼠子宫重量指数、子宫肌层和子宫内膜层厚度发育具有明显的促进作用,而对子宫腺体数量增加无影响.结论 PMSG对幼鼠卵巢的发育无明显影响;PMSG对出生后第15天前后的子宫发挥作用,而且其作用随着出生日龄的增加而增强.     

年龄和妊娠状态对蒙古利亚矮种母马血清FSH和LH含量影响的研究

为研究年龄和妊娠状态对繁殖季节蒙古利亚矮种母马血清垂体促性腺激素含量的影响,本试验选择了10匹4岁～16岁妊娠和22匹0.5岁～17岁非妊娠的蒙古利亚矮种母马,采用放免法分别测定其血清中垂体促性腺激素的浓度。结果:妊娠母马的血清LH和FSH含量分别为0.6567±0.4061mIU/ml和0.3083±0.1611mIU/ml,显著低于非妊娠母马的2.3855±0.3529mIU/ml和2.4059±0.6446mIU/ml(P<0.05);此外,3～8岁组、10～14岁组和15岁以上组非妊娠母马血清LH和FSH含量分别为1.8400±0.8000mIU/ml、2.5929±0.5930mIU/ml、3.9750±0.4850mIU/ml和2.4400±0.7800mIU/ml、2.4000±1.3078mIU/ml、5.3750±0.8850mIU/ml。结论:在繁殖季节,妊娠与否是决定母马血清LH和FSH含量变化的关键因素,而非妊娠母马的血清LH和FSH含量变化与年龄有关。     

小鼠皮肤及其毛囊早期发育的组织学观察

目的探讨小鼠皮肤及其毛囊的早期发育规律。方法采用常规石蜡切片和H-E染色技术,观察昆明系小鼠出生前后皮肤及其毛囊的形态发育。结果(1)孕龄16 d胎鼠的皮肤表面形成凹凸不平的深褶皱,但在生后3 d~5 d不仅皱褶的数量减少,而且凹陷变浅;(2)胎鼠孕龄16 d至19 d,其皮肤的表皮、真皮及皮肤总厚度呈现平稳增厚。但是,出生后,其表皮、真皮和皮肤总厚度急剧降低;在生后第1天至第9天,表皮呈现平稳增厚,而真皮则在生后快速厚度,第7天达到最高值(1861.50μm);(3)孕龄16 d的胎鼠皮肤中可观察到初级毛囊,至生后第7天其密度呈现平稳增长;与其相比,次级毛囊从18 d胎鼠开始出现,其密度增长非常迅速,出生后第7天达到1257.14/mm;毛囊的总密度与次级毛囊呈现相似的变化趋势。出生第7天后,由于毛囊的数量急剧增加,无法观察初级毛囊和次级毛囊的变化规律;(4)初级毛囊和次级毛囊的长度与深度变化在出生前后的相对缓慢,与其相比在第3天以后至第7天呈现迅速变化趋势。结论小鼠皮肤及其毛囊的生长性发育发生在胎儿晚期和生后的早期,而其周期性变化可能从出生后的第9天以后开始出现;在孕期16 d至生后第7天可能是检测毛囊特异性基因表达的最佳期。     

不同温度保存的山羊皮肤成纤维细胞的培养

为了丰富获取山羊成纤维细胞的途径．本研究将采集到的幼山羊耳廓皮肤组织在4℃和20℃下保存一段时间后,进行原代和传代培养其成纤维细胞,并将传代培养的成纤维细胞经冷冻一复苏后进行继代培养。其结果显示。与对照组（新鲜皮肤1成纤维细胞在原代培养时的贴壁需要2d和达到80％汇合需要8d相比,皮肤在20℃下保存12h和24h后,其成纤维细胞的原代培养贴壁时间（3-6d）和80％汇合时间（12～14d）有所延迟;而皮肤在4℃下保存24h和48h后,其成纤维细胞的贴壁所需要时间为3d,达到80％汇合所需要时间为10d;与对照组传代培养达到80％;12合所需要的时间f3d）相比,源于在20℃和4℃下保存的皮肤原代成纤维细胞．经传代培养后,其继1代和继2代成纤维细胞可在第3d或4d达到约80％汇合;与对照组传代培养的成纤维细胞经冷冻一复苏后进行继代培养时,达到80％i12合所需要的时间（4d）相比,源于在20℃和4℃下保存的皮肤传代培养成纤维细胞,无论保存时间长短,均可在开始培养后第4或第5d达到约80％;12合。上述结果表明,山羊死亡后在4—20℃下即使保存1-2d,仍能利用其皮肤获得与源于新鲜皮肤的成纤维细胞相似的正常的成纤维细胞。     

~(60)Co-γ射线辐照对小儿清肺丸中5种有效成分的影响

目的建立同时测定小儿清肺丸中葫芦素B、葫芦素E、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E 5种活性成分含量的方法,考察~(60)Co-γ射线辐照前后有效成分含量的变化。方法采用Agilent-C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相A为甲醇-乙腈(1∶1),B为0.5%冰醋酸水溶液,梯度洗脱,检测波长分别为230、321 nm,体积流量为1.0 mL/min,柱温25℃。分别选择辐照剂量为2、4、6、8 k Gy对小儿清肺丸进行辐照,比较辐照前后小儿清肺丸中5种活性成分含量的变化,并进行成组t检验考察其显著情况。结果葫芦素B、葫芦素E、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E分别在0.049~1.247、0.079~1.973、0.056~1.406、0.028~0.705、0.028~0.693μg有良好线性关系,平均加样回收率分别为101.2%、99.7%、99.9%、98.9%、100.5%,RSD分别为0.6%、0.5%、1.2%、1.1%、1.2%;经过2、4、6、8 k Gy辐照后,小儿清肺丸所含有效成分葫芦素B、葫芦素E、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E均有变化,经成组t检验,在超过6 k Gy后,葫芦素B辐照前后含量变化显著(P0.05)。结论所建立的小儿清肺丸活性成分测定方法回收率高,重复性好,简单实用,可作为小儿清肺丸质控方法。在辐照剂量不超过6 k Gy时,各成分变化不显著,可为小儿清肺丸辐照灭菌手段提供参考。     

绵羊c-Myc的克隆与序列分析

参照GenBank上绵羊c-Myc序列设计引物,利用RT-PCR技术从60d左右胎羊生殖嵴总RNA中扩增得到绵羊c-Myc基因编码区序列,其为包括终止密码子在内的1320 bp,编码有439个氨基酸。同源性分析结果显示,绵羊c-Myc基因编码区与牛、猪、猫、人、大鼠、小鼠、鸡、爪蟾和斑马鱼的核苷酸序列同源性分别为98.0%、94.1%、92.4%、90.4%、86.9%、86.2%、75.2%、66.4%和63.9%,其氨基酸序列同源性分别为98.0%、94.0%、92.5%、90.3%、87.2%、86.5%、72.2%、65.5%和64.6%;生物信息学软件分析显示,绵羊c-Myc含有细胞核定位模体和HLH结构域。本研究为进一步研究c-Myc基因的功能及探讨其中绵羊体细胞重编程中的作用奠定了基础。     

齿痛消炎灵颗粒HPLC特征指纹图谱研究及多成分定量测定

目的建立齿痛消炎灵颗粒(CXG)的HPLC指纹图谱,并进行多成分定量分析,为评价其质量提供依据。方法采用Dikma Luster ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱:0~15 min,20%~30%甲醇;15~30 min,30%甲醇;30~40 min,30%~60%甲醇;40~55 min,60%甲醇;体积流量1.0 m L/min;检测波长254、283、274、300 nm;柱温30℃。通过相似度评价对10批次CXG指纹图谱进行质量评价,并对指认的6个指标成分进行定量测定。结果共确定CXG HPLC指纹图谱18个共有峰,通过与混合对照品比较指认其中6个指标成分分别为升麻素苷(4号峰)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(7号峰)、胡薄荷酮(10号峰)、橙皮苷(15号峰)、丹皮酚(16号峰)和欧前胡素(17号峰),利用相似度软件对10批样品指纹图谱进行分析,各批样品相似度均在0.9以上。升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、橙皮苷、丹皮酚和欧前胡素线性范围分别为0.013~0.505 mg/m L(r=0.999 8)、0.052~2.097 mg/m L(r=0.999 2)、0.019~0.772 mg/m L(r=0.998 9)、0.025~1.003 mg/m L(r=0.999 1)、0.006~0.251 mg/m L(r=0.999 5)和0.014~0.576 mg/m L(r=0.999 4)。10批样品中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、胡薄荷酮、橙皮苷、丹皮酚和欧前胡素线质量分数分别在7.267~7.333 mg/g、4.260~4.522 mg/g、2.033~2.093 mg/g、12.234~12.771 mg/g、19.023~19.334 mg/g和11.152~11.291 mg/g。结论所建立的CXG HPLC指纹图谱和定量测定分析方法灵敏度高、专属性强,可用于CXG的质量控制。     

小鼠Lin28基因的克隆及原核表达

目的 探讨获取小鼠Lin28蛋白的方法.方法 提取8.5 d ICR小鼠胚胎mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点(Nco Ⅰ及Xho Ⅰ)引物,从该cDNA中扩增出Lin28基因编码区序列;将获得的Lin28基因编码区序列克隆到pMD18-T载体上.对质粒双酶切回收其中Lin28基因片段,与pET-30a(+)载体相连接并转化Rosetta( DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对表达结果进行分析.结果 对所克隆的Lin28蛋白编码区的DNA序列分析表明,Lin28 CDS区包括终止密码子在内为630 bp,与参照DNA( NM_145833)相比同源性为99.37％,与参照氨基酸序列相比同源性为100％;在IPTG诱导下pET-30a(+)-Lin28重组质粒可表达与预期相符的约为27.5×103的蛋白质.结论 利用克隆的小鼠Lin28基因,采用原核表达方法,成功获得小鼠Lin28蛋白,为进一步开展以重组蛋白诱导体细胞重编程研究奠定基础.     

小鼠Klf4基因的克隆及原核表达分析

目的 克隆Klf4基因并对其重组蛋白进行原核表达及分析.方法 提取胎鼠皮肤mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点引物,从该cDNA中扩增出Klf4基因编码区序列,将其克隆到pEasy-T3载体上.对质粒双酶切并回收其中Klf4基因片段后,克隆入pET-52b(+)载体后转化Origmai B(DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析.结果 对所克隆的Klf4 mRNA蛋白编码区的DNA序列分析表明,klf4 CDS区包括终止密码子在内为1452 bp,与参照序列对比仅有四处存在差异,不仅其同源性达到99.72%,且其氨基酸序列同源性为100%;在IPTG诱导下pET-52b(+)-Klf4重组质粒可表达与预期相符的约为57×103的蛋白质;经IPTG刺激后重组蛋白表达明显上调,其中IPTG为0.4 mol/L时效果最佳.结论 从胎鼠皮肤中克隆的Klf4基因可在原核中表达.