弓形虫虎源分离株ROPIO基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因，将其克隆入pMD18．T载体中进行测序和生物信息学分析，并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp，编码586个氨基酸，其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，16个核苷酸存在变异，导致7个氨基酸发生改变，但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异，两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．8％。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌B121（DE，）在IPTG的诱导下，可表达出分子量为67．6kDa的重组蛋白，表达量占菌体蛋白的13．8％。     

新型冠状病毒RBD区重组流感病毒的拯救及初步鉴定北大核心CSCD

目的利用流感反向遗传技术,以B型流感病毒B/Yamagata/16/88株作为骨架,表达新型冠状病毒(SARSCoV-2)S蛋白的受体结合域(RBD),构建以B型流感病毒为载体的新型冠状病毒疫苗候选株。方法基因合成新冠病毒参考株S蛋白上的RBD基因片段(318-541aa),对B型流感病毒B/Yamagata/16/88/的NS1片段进行设计改造并插入RBD序列,构建重组质粒NS110-RBD。将NS110-RBD与其余7个骨架株重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞,拯救表达新型冠状病毒RBD区重组流感病毒,对拯救出的毒株进行形态学、分子生物学鉴定及病毒滴度和Western blot检测。结果成功拯救出重组流感病毒株并命名为rIBV-NS110-RBD。PCR鉴定RBD目的基因大小正确,测序表明拯救病毒株的序列正确,在透射电镜下观察到拯救病毒株的病毒粒子具有流感病毒粒子的典型特征。经测定,拯救株rIBV-NS110-RBD在MDCK细胞上的病毒滴度为10^(5.5) TCID_(50)/ml,在鸡胚上的病毒滴度为10^(6.5) EID_(50)/ml,血凝效价最高达2_(5);Western Blot检测到RBD的表达,其分子质量为35ku。结论成功拯救出高表达新型冠状病毒RBD蛋白的高血凝效价的重组流感病毒株,该病毒具有流感病毒粒子的典型特征,为以B型流感病毒为载体作为新型冠状病毒疫苗的研发提供了新思路。     

犬细小病毒VP2蛋白在家蚕/昆虫细胞中表达

目的犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)能够引起犬急性出血性肠炎,在幼犬中的死亡率很高,为我国养犬业和经济动物养殖业带来巨大的经济损失。因而,寻找一种新型、安全、高效的疫苗为细小病毒性肠炎的防控具有重要意义。方法本研究利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达CPV VP2蛋白的重组杆状病毒rBV-D-VP2。该重组病毒感染昆虫细胞和家蚕后,表达CPV VP2蛋白。体外表达的VP2蛋白自动装配成病毒样粒子。随后用蚕蛹中大量组装成的病毒样粒子分别通过口服和肌注两种途径免疫豚鼠。结果经电镜检测,观察到直径为25nm大小的球形病毒样粒子,表明重组杆状病毒表达的VP2能形成病毒样粒子,且在大小、形态上与天然病毒相似。间接免疫荧光检测表明成功构建了表达VP2的病毒样粒子。口服和肌注两种途径免疫豚鼠,均产生了血凝抑制效价。结论本研究为CPV新型亚单位疫苗的研究提供了依据。     

B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

【摘要】 目的 本研究利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法 通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以105EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果 成功从体外拯救出B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性; 攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论 成功搭建B型流感病毒冷适应株B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究还较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。     

狂犬病病毒HEP-Flury-mEG株的拯救与鉴定

目的拯救狂犬病毒HEP-Flury-mEG株,为疫苗制备奠定基础。方法将ERA株G蛋白333位毒力位点修饰为谷氨酸后替换至HEP-Flury株基因组。重组感染性克隆质粒和4个辅助质粒,共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒。结果 IFA鉴定成功拯救出了HEP-Flury-mEG株狂犬病病毒。重组病毒G基因经XholⅠ酶切,片段大小为1 071bp和520bp,与预期结果相符。重组病毒在BHK-21细胞中传代4次,滴度维持在1×107.5 FFU/ml。重组病毒经常规负染后在电镜下为弹状粒子,长度和直径与亲本株一致。结论获得了重组狂犬病毒HEP-Flury-mEG株。该病毒滴度高,形态完整,传代稳定,为进一步研究狂犬病毒病毒的生物学特性和新型基因工程疫苗奠定了基础。     

小胶质细胞在病毒性中枢神经系统感染中的作用

小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞,是中枢神经系统抵抗病原体入侵的第一道防线。当病原微生物进入脑组织后,小胶质细胞迅速做出反应,识别、吞噬病原微生物,呈递抗原和分泌多种生物活性物质。但是,小胶质细胞的过度活化又可诱发中枢神经系统免疫病理损伤或神经退行性病变。因而,具有生理和病理双重作用。本文就小胶质细胞在病毒感染性中枢神经系统疾病中的作用及其机制进行综述。     

狂犬病病毒弱毒疫苗株反向遗传操作系统的建立

目的构建狂犬病病毒弱毒疫苗株SRV9全长cDNA感染性克隆,并建立其反向遗传操作系统。方法通过DNAStar对狂犬病病毒SRV9株全长基因组序列进行分析,利用单一的酶切位点,将SRV9全长cDNA分为4段,根据每段重叠区域的酶切位点拼接全长,分别连入pCI和pCDNA3.1(+)载体,并通过PCR方法分别在全长序列的3′端和5′端引入核酶HamRZ和HdvRZ序列,构建全长真核表达质粒pCI-SRV9和pD-SRV9。同时构建能表达狂犬病病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)的4个辅助质粒。分别将pCI-SRV9或pD-SRV9与辅助质粒通过脂质体共转染BSR细胞,拯救重组病毒。结果两种质粒表达系统均可拯救到有感染活性的病毒粒子,但pD-SRV9表达质粒的拯救效率(8/8)较pCI-SRV9表达质粒拯救效率3/30高;重组病毒与母本野生病毒的体外生长动力学曲线相一致,相同培养时间的病毒滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建了狂犬病病毒弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,为进一步研究狂犬病病毒致病机理、筛选新型狂犬病疫苗或开发基于狂犬病病毒载体的其他疾病疫苗奠定了基础。     

布鲁氏菌基因组学研究进展北大核心CSCD

布鲁氏菌是一类革兰氏阴性、胞内寄生菌,缺乏经典的毒力因子,致病性不仅依靠侵袭力和内毒素,还有赖于较强的环境适应能力。目前,布鲁氏菌入侵机体和在胞内持续存在的机制尚未明确。布鲁氏菌基因组学研究不仅可全面了解布鲁氏菌的基因组成、分子进化、毒力因子以及致病机制等特点,还可以对一些致病相关基因和重要的蛋白进行预测。该研究为开发研究疫苗和新型抗生素提供分子基础,从而为构建新的有效的布病治疗和防控策略提供理论依据。本文就布鲁氏菌的基因组组成、特征,全基因组测序分析、比较基因组研究进展予以概述。     

野生动物疫病与公共卫生

目前，现代医学所认知的1145种人类传染性疾病中，有62％的疾病来源于动物。动物源性疫病作为一个重要的人类公共健康问题，日益受到世界各国的重视。近年来，随着人们对传染性疾病中溯源研究的深入，发现野生动物疾病与人类的健康有着直接关系。如埃博拉病毒源于非洲东部的类人猿。人类免疫缺陷病毒也源于野生灵长类动物。SAILS来源于蝙蝠。禽流感病毒来源于野生水禽，且通过家禽而传染给人类。另一方面，野生动物可能受到人类或家养动物疫病的威胁，例如，国家公园的狮子群体由于感染犬瘟热而即将面临着绝种，而该病是通过家养犬传染给狮子的；还有现在非洲的野狗正在受源于家养犬狂犬病的侵袭，因而对于许多濒危野生动物来说，野生动物疾病会加速其灭绝的速度。因此，人类必须加强对野生动物源性疫病的充分认识和重视，建立跨学科、国际间的整体合作和交流，实施疫病的监测、实验研究和防控工作，把野生动物源性疫病作为全球疾病预防、监测、监控和防治的一个重要组成部分，为人类的健康及人类社会的进步提供保障。[第一段]     

禽流感病毒免疫血清对实验感染小鼠的紧急预防效果研究

目的 评价H5N1亚型禽流感病毒免疫血清对实验感染小鼠的紧急预防保护效果.方法 给30只小鼠腹腔注射0.2 ml/只禽流感病毒免疫血清,注射后1～19 d内每天采3只小鼠血清测定血凝抑制(HI)抗体效价,测定免疫血清在小鼠体内的消长规律;给10只小鼠腹腔注射1.5 ml/只禽流感病毒免疫血清,检测免疫血清对小鼠的安全性;将70只小鼠按数字表法随机分为7组,分别为正常对照组、病毒对照组以及免疫血清高剂量早期组、高剂量中期组、高剂量晚期组、中剂量组、低剂量组.每组10只,分别在攻毒前8 d,4 d和1 d时腹腔注射血清0.2 ml/只、0.1 ml/只、0.05 ml/只禽流感病毒免疫血清,然后给小鼠滴鼻感染10个半数致死量(LD50)病毒,攻毒后连续观察14 d,计算小鼠存活率和平均存活天数,比较各实验组小鼠肺指数及肺脏病毒感染滴度.结果注射0.2 ml免疫血清小鼠HI抗体效价在1～15 d时为26,在17 d以后开始下降;1.5 ml免疫血清注射小鼠全部存活,没有发病;在攻毒前8 d、4 d和1 d时给小鼠腹腔注射0.2 ml免疫血清,小鼠存活率分别为80%、100%和100%,平均存活天数分别为13.1 d、14.0 d和14.0 d,在攻毒前1 d给小鼠腹腔注射0.1 ml和0.05 ml免疫血清,小鼠存活率分别为100%和50%,平均存活天数分别为14.0 d和11.7 d,各实验组小鼠肺指数(O.0096±0.0033～0.0145±0.0060)均小于病毒对照组(0.0199±0.0025),除低剂量组外,均具有统计学意义(P值0.0022～0.0470,＜0.05),各实验组小鼠肺脏病毒滴度(TCID50)较病毒对照组平均低2个滴度.结论禽流感病毒免疫血清对实验感染小鼠具有较好的紧急预防保护效果,可作为人禽流感紧急预防制剂加以研究开发.