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目的:构建调控β-半乳糖苷酶(β-gal)基因表达的四环素基因表达调控载体,验证其在肝癌细胞内调控β-半乳糖苷酶基因的表达,为进一步利用该调控系统调控治疗基因治疗肝癌奠定实验基础。方法:根据2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因与pcDNA3.1载体的基因核苷酸序列,设计引物,以pcDNA3.1载体为模板进行PCR。将具有串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因的PCR产物连接入pcDNA3.1载体CMV启动子下游,构建成pcDNA3.1-TetO2载体,应用ABI 3130 测序仪利用pcDNA3.1-TetO2载体对TetO2 PCR产物进行测序分析。再将β-gal克隆入pcDNA3.1-TetO2载体,构建成受四环素调控表达的β-半乳糖苷酶基因的表达载体pcDNA3.1-TetO2-β-gal。利用脂质体将携带四环素调控子基因(TR)的pcDNA6/TR载体转染到肝癌细胞HepG2中,利用杀稻瘟菌素进行细胞转染的稳定筛选,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测TR基因在HepG2细胞内的表达。将pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体转染到稳定表达pcDNA6/TR的HepG2细胞中,转染3~4 d后,给予强力霉素(4 mg•L-1),利用β半乳糖苷酶原位染色试剂盒染色,检测β-半乳糖苷酶基因的表达。结果:构建的pcDNA3.1-TetO2载体测序结果表明,串联2个四环素调控子结合位点(TetO2)基因片段插入到pcDNA3.1载体CMV启动子基因下游。pcDNA3.1-TetO2-β-gal载体酶切鉴定结果表明,β-gal成功地克隆入pcDNA3.1-TetO2载体。RT-PCR结果显示,TR基因在pcDNA6/TR转染的经杀稻瘟菌素筛选的HepG2细胞内得到稳定表达。给予强力霉素后,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞 内得以表达;而未给予强力霉素,β-半乳糖苷酶基因在稳定转染TR 基因的HepG2 细胞内表达受到抑制。结论:成功地构建了调控β-半乳糖苷酶基因表达的四环素基因表达调控载体,利用该载体成功地调控了β-半乳糖苷酶基因在HepG2细胞内的表达。 相似文献
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重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响 总被引:5,自引:2,他引:3
目的构建人骨形成蛋白-2(hBMP-2)真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-2,转染人骨髓基质干细胞(MSCs),探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法利用重组DNA和基因克隆技术构建重组载体pcDNA3.1-hBMP-2;细胞培养和基因转染技术体外转染人MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞BMP-2的表达;通过流式细胞仪和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和VEGF表达的影响. 结果转染后细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达BMP-2;转染后S期细胞比例增多,提示细胞DNA的合成增加;BMP-2基因转染上调细胞VEGF的表达. 结论在脂质体介导下,pcDNA3.1-hBMP-2转染MSCs获得成功.基因转染后能促进细胞增殖并将通过使VEGF的表达增加促进血管再生,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础. 相似文献
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重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨 总被引:3,自引:2,他引:1
目的:构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,,hBMP-2)真核表达载体PcDNA3.1-hBMP-2,转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells,BMSCs),种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone,BCB)支架体外构建组织工程骨。方法:蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达,碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果:转染后,BMSCs表达BMP-2,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀,伸展良好。结论:在脂质体介导下,BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好,为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。 相似文献
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目的:探讨活性氧过氧化氢(H2O2)对心肌细胞损伤作用。方法:用不同浓度的H2O2作用于新生鼠培养心肌细胞,通过琼脂糖凝胶电泳、Giemsa染色和流式细胞仪等方法观察H2O2对心肌细胞的凋亡性损伤作用,同时检测培养介质中乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)等生化指标的改变。结果:5 mmol/L H2O2作用于培养心肌细胞6 h,在琼脂糖凝胶电泳上出现梯状DNA带;Giemsa染色细胞涂片可见到染色体浓聚或边缘化,成新月型聚集在核膜周边,并有凋亡小体的存在;流式细胞仪可检测出亚二倍体峰的出现。结论: H2O2具有浓度和时间依赖关系诱导心肌细胞的凋亡,在低浓度H2O2(<1 mmol/L)导致培养心肌细胞的早期生物化学改变,自由基含量升高,膜通透性增加,同时伴有少量心肌细胞凋亡;而在高浓度H2O2(>10 mmol/L)时会造成培养心肌细胞的坏死性死亡,细胞膜崩塌,脂质过氧化物(MDA)大量产生,LDH大量泄漏,DNA琼脂糖凝胶电泳出现弥散(smear)泳带;5~10 mmol/L H2O2诱导大量心肌细胞凋亡性死亡,同时伴有LDH和MDA含量升高等生物化学的改变。 相似文献
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人WAF1基因的克隆及其生物调控作用 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 克隆人WAF1基因,构建成WAF1-pcDNA3真核表达质粒,探索WAF1基因的生物调控功能。方法 采用RT-PCR和DNA直接测序方法从Hela细胞中扩增人WAF1基因,通过克隆到pcDNA3真核克隆载体上,用脂质体法转染Hct-8细胞;经免疫荧光和免疫组化方法鉴定WAF1外源基因的表达活性和对Rb基因,cyclinD1基因的调控作用。结果 从Hela细胞扩增的从WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中,获得了人WAF1-pcDNA3重组质粒和高效表达P21WAF1/CIP1的Hcl-8细胞株;证实了WAF1具有促进Rb,抑制cyclinD1蛋白表达的调控作用。结论 成功地构建了人WAF1表达质粒WAF1-pcDNA3,外源基因WAF1的表达对下游基因具有生物调控效应。 相似文献
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人CD200基因克隆及pcDNA3-CD200表达质粒的构建 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:克隆人CD200基因并构建pcDNA3-CD200表达质粒。
方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法,从用200 μg Con A刺激62 h后的正常人外周血白细胞中扩增出CD200基因,与pMD18T载体连接后,做全自动DNA测序,并用亚克隆的方法构建pcDNA3-CD200表达质粒。
结果:从正常人外周血白细胞扩增的人CD200基因与GenBank中人CD200序列(NM -005944)完全相同。
结论:成功地克隆人CD200基因并构建了pcDNA3-CD200表达质粒。 相似文献
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STZ小剂量多次注射诱导大鼠胰岛素依赖性糖尿病动物模型探讨 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 :探索一种应用于糖尿病研究中理想的动物模型。方法 :腹腔注射 30 mg/kg的链脲佐菌素 (STZ) ,每周一次连续 4周 ,诱导大鼠产生慢性自身免疫胰岛损害 ,观察血糖、尿糖及组织学损害。结果 :实验组大鼠产生明显迟发性胰岛损害 ,尿糖阳性 ,血糖与对照组有明显差别 ,组织学表现为自身免疫性胰岛炎特征。结论 :STZ小剂量多次注射诱导大鼠胰岛素依赖性糖尿病 (IDDM)动物模型适用于糖尿病发病机理的研究。 相似文献
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目的 制备并研究bFGF单克隆抗体,以便用于恶性肿瘤的早期诊断。方法 提纯bFGF并用杂交瘤技术获得杂交瘤细胞,再用BALB/C鼠种植收获腹水得到McAb,进行核型、效价、特异性、表位等分析。结果 所得杂交瘤细胞具有双亲细胞染色体特点McAb效价较高,特异性良好,无非特异反应,3种McAb均为IgG型。结论 McAb具有良好的性能,为进一步的临床检测应用奠定了基础。 相似文献
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目的 :克隆人 WAF1基因 ,构建成 WAF1 - pc DNA3真核表达质粒。方法 :采用逆转录聚合酶链反应从 Hela细胞中扩增人 WAF1基因 ,并克隆到 pc DNA3真核克隆载体中。结果 :从 Hela细胞扩增的人 WAF1基因克隆至真核克隆表达载体 pc DNA3中 ,经 DNA直接测序 ,获得了 WAF1 -pc DNA3重组质粒。结论 :成功地构建人 WAF1表达质粒 WAF1 - pc DNA3,为进一步研究 WAF1基因表达及生物学效应奠定了基础。 相似文献