改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

针对牙周进修医生分阶段能力提升的教学模式思考与探索

牙周进修医生教学是牙周病学教学体系中不可或缺的一环,对于解决当前我国牙周病诊治医患失衡矛盾具有重要意义.文章以北京大学口腔医学院牙周进修教学30余年的经验为基础,根据牙周系统治疗的专业特点,总结和探索牙周进修教学分阶段能力提升的教学模式.该模式将一年期进修教学以3个月为界,分为4个阶段.第一阶段为熟练掌握牙周专业理论知...     

侵袭性牙周炎维生素D受体基因多态性的FBAT分析

目的：运用家系为基础的相关性检验(family based associated test, FBAT)方法,分析侵袭性牙周炎(aggressive periodontitis, AgP)与维生素D受体基因多态性(Taq Ⅰ和Fok Ⅰ)的关联。方法：纳入93个核心家系的93个先证者和155个一级亲属,先证者和亲属VDR多态性位点的基因分型联合应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR)和限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)法完成。结果：研究人群的T和t等位基因频率分别为94.6%和5.4%,未发现tt基因型,先证者父亲的t等位基因频率显著高于母亲（9.8% vs 1.6%,P=0.005）;研究人群的F和f等位基因频率分别为57.1%和42.9%。FBAT检验的加性模型、隐性模型和显性模型均未显示VDR Taq Ⅰ和Fok Ⅰ位点的基因多态性与AgP相关(P>0.05)。结论：本研究对中国人AgP家系成员VDR基因多态性进行了初步分析,FBAT检验的结果未显示VDR Taq Ⅰ和Fok Ⅰ位点与AgP相关,其中VDR Taq Ⅰ位点有信息的家系数目较少可能影响FBAT的分析结果。     

侵袭性牙周炎患者血浆25羟维生素D_3和骨钙素相关分析

目的:探讨血浆25羟维生素D3(250HD3)、骨钙素(osteocalcin,OCN)和侵袭性牙周炎(aggressive periodontitis,AgP)的关系.方法:选取34例AgP患者和29例牙周健康者,抽取空腹静脉血,采用放射免疫法测定血浆中250HD3和OCN,全自动血生化仪分析血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(asparate aminotransferase,AST),比较两组的差异,并分析各组血浆250HD3和OCN的相关性.结果:AgP患者血浆250HD3的水平为8.65μg/L,高于健康对照者(3.10μg/L,P＜0.01);AgP患者血浆OCN的水平(1.0μg/L)高于健康对照者(0.8μg/L,P=0.028);AgP患者血清AST水平为20.0 U/L,低于健康对照者(23.0U/L,P=0.049).血浆250HD3和OCN水平在AgP患者和健康者中均未发现相关关系(r=0.271,P=0.12;r=-0.356,P=0.58).结论:AgP患者血浆250HD3和OCN水平未见相关,其升高可能与牙周炎有关.     

釉基质蛋白对人牙周膜细胞生物学影响的体外研究

目的：了解釉基质蛋白对人牙周膜细胞的增殖、矿化、蛋白合成及超微结构的影响。方法：组织块法原代培养人牙周膜细胞,茜素红染色进行细胞表型的鉴定;采用细胞增殖试剂盒及流式细胞仪检测釉基质蛋白对人牙周膜细胞增殖及细胞周期的影响;BCA蛋白定量试剂盒分析釉基质蛋白对牙周膜细胞蛋白合成的影响;并用透射电镜观察牙周膜细胞超微结构的改变;免疫组化染色观察釉基质蛋白作用下对牙周膜细胞骨涎蛋白和骨桥蛋白表达的影响。结果：釉基质蛋白可促进牙周膜细胞增殖,促进牙周膜细胞DNA的合成,使牙周膜细胞周期的G1 期细胞所占百分比降低,而S期细胞所占百分比升高,并可提高牙周膜细胞蛋白总量,透射电镜观察可见经釉基质蛋白作用后的牙周膜细胞胞浆丰富,与蛋白合成相关细胞器粗面内质网及高尔基体发达,釉基质蛋白可促进牙周膜细胞矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。结论：釉基质蛋白能促进牙周膜细胞增殖、蛋白合成及矿化相关蛋白骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达,促进牙周组织的再生。     

维生素D受体FokⅠ多态性对牙周组织细胞CYP24A1表达的影响

目的：维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）基因的第二外显子存在唯一一个可以影响VDR蛋白结构的多态性位点,其可以由限制性核酸内切酶FokⅠ所识别,分为FF、Ff和ff三型。CYP24A1是维生素D 24羟化酶的编码基因,是常见的维生素D效应基因。本研究将探讨人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,hGF）和牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLC）中VDR FokⅠ多态性对CYP24A1表达的影响。方法：原代培养12名供体的hGF和hPDLC,提取基因组DNA,PCR扩增包含多态性位点的267 bp的片段。根据FokⅠ对片段酶切的结果判断VDR-FokⅠ基因型。确定基因型后,给各基因型hGF和hPDLC以10 nmol/L 1α,25双羟维生素D3（1,25OH2D3）或1 000 nmol/L 25羟维生素D3（25OHD3）刺激48 h,提取RNA,其中10 nmol/L 1,25OH2D3刺激48 h后还提取蛋白。之后给予hGF和hPDLC VDR拮抗剂ZK159222,再以10 nmol/L 1,25OH2D3或1 000 nmol/L 25OHD3刺激48 h,提取RNA。应用Real-time PCR和Western blot的方法检测维生素D24羟化酶CYP24A1和VDR的mRNA和蛋白的表达水平。结果：12名供体中,FF、ff和Ff型分别为4例、3例和5例。1,25OH2D3刺激hGF和hPDLC后,FF型细胞CYP24A1的mRNA表达水平显著高于Ff型或ff型细胞（hGF：F=31.147,P＜0.01;hPDLC：F=23.347,P＜0.01）;FF型细胞CYP24A1的蛋白表达水平同样显著高于Ff型或ff型细胞（hGF：F=12.368,P＜0.01;hPDLC：F=15.749,P＜0.01）。25OHD3刺激hGF和hPDLC后,FF型细胞CYP24A1的mRNA表达水平也显著高于Ff型或ff型细胞（hGF：F=32.061,P＜0.01;hPDLC：F=32.569,P＜0.01）。如1,25OH2D3刺激伴有ZK159222,则三型细胞CYP24A1的mRNA表达水平差异无统计学意义（hGF：F=0.246,P=0.787;hPDLC：F=0.574,P=0.583）。如25OHD3刺激伴有ZK159222,则三型细胞CYP24A1的mRNA表达水平差异也无统计学意义（hGF：F=1.636,P=0.248;hPDLC：F=0.582,P=0.578）。不同刺激条件下,hGF和hPDLC两种细胞比较CYP24A1或VDR的表达水平,差异均无统计学意义。结论：在hGF和hPDLC中,FF型VDR可介导比其他基因型VDR更为显著的CYP24A1上调,提示FF型VDR可能具有更强的转录活性。     

基于循序渐进的模型训练提高牙周进修医生手术胜任力

牙周进修医生教学是牙周病学教学体系中的重要组成部分,对于全国各地培养牙周专业人才至关重要。中重度牙周炎的手术治疗是牙周临床诊疗水平的重要体现。北京大学口腔医学院牙周病学教研室在既往教学实践基础上,建立了一套基于仿真和动物颌骨模型循序渐进地进行牙周基础性手术、牙周再生性手术和膜龈手术操作训练的模式,在一定程度上弥补了临床手术实践不足的问题,并提升了牙周进修医生对不同种类牙周手术的胜任力,为探索我国1年期牙周进修医生的手术教学方法提供了参考。     

牙周手术治疗对猴Ⅲ度根分叉病变模型龈下菌斑中牙周致病微生物的影响

目的：纵向观察猴在自然状态下（Ⅲ度根分叉病变建立前）,根分叉病变建立后牙周手术治疗前,以及手术治疗后6个月时,根分叉部位龈下菌斑中5种牙周可疑致病菌检出率的变化。 方法：在猴下颌双侧第二前双尖牙、第一磨牙和第二磨牙制备慢性Ⅲ度根分叉病损后,行牙周手术治疗,3只猴共18个牙位。分别在自然状态下（Ⅲ度根分叉病变建立前）,根分叉病变建立后牙周手术治疗前,以及手术治疗后6个月时,取根分叉部位（颊、舌侧）的龈下菌斑。每只猴每时间点有12个样本,3只猴36个菌斑样本,用16SrRNA为基础的PCR技术检测样本中5种牙周可疑致病菌：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）、福赛坦氏菌（Tannerella forsythensis,Tf）、齿垢密螺旋体（Treponema dinticola,Td）、伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans,Aa）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum,Fn）。结果：根分叉病变模型建立后,局部炎症明显,牙周手术后6个月根分叉区牙周组织有一定程度的修复,但局部炎症依然存在,Pg、Tf、Td和Fn的检出率均逐渐显著增加,分别从58.3%、69.4%至88.9%（P<0.01）,从47.2%、69.4%至83.3%（P<0.01）,从13.9%、36.1%至61.1%（P<0.01）,从69.4%、91.7%至91.7%（P<0.05）。Aa的检出率3次取样变化不大（从25.9%、13.9%至33.3%）。同时检出3种以上微生物的检出率从38.9%、61.1%至83.3%（P<0.01）,以及红色复合体（Pg + Tf + Td）的同时检出（从8.3%、27.8%至44.4%,P<0.01）也逐渐明显增加。根据术后6个月组织学有无炎症细胞浸润,分成8个感染牙位和10个未感染牙位,术后6个月感染位点与其根分叉病变建立后牙周手术治疗前的红色复合体检出率（87.5%,62.5%）明显高于根分叉病变建立前（0.0%,P<0.01）。虽然均高于非感染部位（60.0%,40.0%）,但差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论：红色复合体（Pg 、Tf 和 Td）在牙周炎的发生和发展中有着重要的作用,Fn则可能是龈下菌斑中的常驻菌,而Aa可能不是慢性牙周炎的主要致病微生物。     

自体牙周膜细胞和釉基质蛋白修复猴下后牙Ⅲ度根分叉病变

目的：应用自体牙周膜细胞(periodontal ligament call, PDLC)结合釉基质蛋白(enamel matrix derivative, EMD)植入人工制备的猴Ⅲ度根分叉病损内, 探讨此牙周组织工程技术治疗重度根分叉病变的可行性。方法：人工制备3只食蟹猴双侧下颌第二双尖牙、第一磨牙和第二磨牙的慢性Ⅲ度根分叉病损。拔除第一双尖牙, 分离牙周膜, 取体外培养的第3代PDLC再与牛无机矿化骨胶原块复合培养后植入病损内。3只猴的一侧第二磨牙植入PDLC/ 牛无机矿化骨胶原块+ EMD为A组; 对侧同名牙植入牛无机矿化骨胶原块 + EMD为B组; 一侧第一磨牙植入PDLC/ 牛无机矿化骨胶原块为C组, 对侧同名牙植入牛无机矿化骨胶原块为D组; 一侧第二双尖牙置入EMD为E组; 对侧同名牙为空白对照组(F组)。所有部位均覆盖胶原膜, 每组3颗牙, 分别于植入材料前和植入后6个月记录牙颊舌侧根分叉部位的牙周袋探诊深度(periodontal depth, PD)和附着水平(attachment level, AL),拍摄X线片。结果: 植入材料后6个月, 除少数根分叉暴露的病损外, 多数根分叉处的PD和AL有不同程度的改善, 依次为E组和F组(第二双尖牙), A组, C组, B组和D组。修复的牙槽骨几乎充满第二双尖牙的根分叉, 甚至可见较清晰的骨硬板, 其他牙位的牙槽骨虽有一定程度的修复, 但在缺损的冠方仍留有较明显的密度减低影。结论: PDLC和EMD均可增加Ⅲ度根分叉病变区牙周组织的修复, 两者联合应用效果更好。Ⅲ度根分叉病变的治疗效果不仅取决于植入的细胞和材料, 而且受多种因素的影响, 尤其是根分叉的大小和牙龈瓣能否很好覆盖病损是影响愈合的重要因素。