大鼠重度烫伤后早期心肌组织内缺氧诱导因子-1α表达的变化

目的　观察烫伤大鼠伤后早期心肌组织中缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)mRNA和蛋白的表达变化 ,探讨其意义。　方法　制作 4 0 %TBSAⅢ度烫伤大鼠模型 ,设正常对照组及伤后不同时相组。取心脏解剖左、右心室 ,采用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)法检测HIF 1αmRNA的表达 ,采用蛋白免疫印迹法测定其蛋白水平的变化。　结果　正常大鼠左、右心室肌HIF 1αmRNA、蛋白表达结果有所不同。大鼠烫伤后 ,心肌组织内HIF 1αmRNA水平、蛋白表达量明显升高 (P <0.0 1)。结论　正常状态下 ,大鼠左心室肌对缺血缺氧耐受能力较右心室肌强。严重烫伤可以诱导大鼠心肌细胞HIF 1α表达增加 ,介导心肌保护效应     

生脉注射液对大鼠烧伤后心肌细胞凋亡的影响

目的 探讨生脉注射液对大鼠烧伤后心肌细胞凋亡的影响.方法 SD(Sprague-Dawley)大鼠72只,随机分成单纯烫伤组(B组,n=36)和烫伤并应用生脉注射液治疗组(S组,n=36),制成30%TBSA Ⅲ度烫伤模型,伤后B组按Parkland公式补液,S组在B组的基础上伤后即刻按4 ml/kg给予生脉注射液,并相应减少补液量,两组均于不同时相点,取左室心肌组织切片,做病理形态学观察,并采用DNA切口末端标记法(TUNEL)和心肌组织caspase-3活性双指标联合检测细胞凋亡.结果 病理切片显示S组较B组心肌组织损伤有所减轻;两组心肌细胞TUNEL显示烫伤后6 h呈阳性,伤后12 h达高峰;caspase-3活性变化早于凋亡形态学变化,于伤后3、6 h达峰值;S组较B组在伤后6、12、24 h心肌细胞凋亡指数显著降低(P＜0.01),左心室心肌组织caspase-3活性在伤后3、6、12 h也显著降低(P＜0.05).结论 烧伤后早期心肌细胞凋亡参与了烧伤病理损伤过程.早期应用生脉注射液治疗可以有效地减少心肌细胞的凋亡,进而减轻心肌的损伤,起到保护心肌的作用.     

微管干预剂对大鼠缺氧心肌细胞能量生成的影响

目的 了解缺氧条件下微管干预剂对大鼠心肌细胞能量生成的影响。方法 常规分离、培养大鼠心肌细胞，分为单纯缺氧组、缺氧＋秋水仙碱（微管解聚剂）组及缺氧＋5、10、15 mmol／L紫杉醇（微管稳定剂）组。每组细胞加入刺激剂后，缺氧培养0．5、1．0、3．0、6．0、12．0、24．0h。采用锥虫蓝染色检测细胞死亡率，常规比色法检测细胞肌酸激酶（CK）活性，高效液相色谱法检测细胞腺苷三磷酸（ATP）及腺苷二磷酸（ADP）含量。结果 （1）缺氧＋秋水仙碱组及缺氧＋15mmol／L紫杉醇组细胞培养1．0～24．0h死亡率均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmoL／L紫杉醇组6．0～24．0h时均低于单纯缺氧组（P〈0．05）。（2）缺氧＋秋水仙碱组培养1．0～12．0h时CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）。0．5～12．0h时，缺氧＋15mmoL／L紫杉醇组CK活性均高于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋5、10mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组（P〈0．05或P〈0．01）。（3）缺氧＋5mmol／L紫杉醇组培养0．5～6．0h ATP含量[（49．9±2．8）、（40．7±2．0）、（25．8±1．9）、（19．1±1．2）μg／10^6个细胞]高于单纯缺氧组[（42．9±5．8）、（29．5±1．8）、（18．2±0．9）、（14．1±0．7）μg／10^6个细胞，P〈0．05或P〈0．01]。0．5～12．0 h时，缺氧＋秋水仙碱组低于单纯缺氧组（P〈0．01）；缺氧＋15mmol／L紫杉醇组低于单纯缺氧组及缺氧＋10mmol／L紫杉醇组（P〈0．01）。各组ADP含量变化趋势与ATP相反。结论 微管解聚剂和高浓度微管稳定剂可使缺氧心肌细胞ATP含量锐减。适宜浓度的微管稳定剂在缺氧早期可促进心肌细胞能量生成，对心肌具有保护作用。     

依那普利拉对严重烫伤大鼠早期心肌力学的影响

目的 了解依那普利拉对严重烫伤大鼠早期心肌力学的影响.方法 将84只SD大鼠背部造成30%TBSA的Ⅲ度烫伤后,随机分为烫伤组,伤后按Parkland公式腹腔注射等渗盐水;小剂量治疗组、中剂量治疗组、大剂量治疗组,伤后即刻分别腹腔注射1、2、4 mg/kg依那普利拉.烫伤组、小剂量治疗组伤后1、3、6、12、24 h,中剂量治疗组、大剂量治疗组伤后6、12 h左心室置管检测大鼠左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室压力最大上升/下降速率(±dp/dt max),并处死大鼠取心肌组织检测血管紧张素Ⅱ(AⅡ)含量.另取6只大鼠作为假伤组,模拟烫伤后检测以上指标.结果 伤后3～24 h,烫伤组及各剂量治疗组大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dt max值普遍低于假伤组(P＜0.05或P＜0.01);而各剂量治疗组LVSP、LVEDP、±dp/dt max值普遍高于烫伤组(P＜0.05或P＜0.01);伤后6、12 h,大剂量治疗组±dp/dt max明显低于小、中剂量治疗组.伤后1 h,烫伤组心肌组织AⅡ含量[(53.0±2.6)pg/200 mg]明显高于假伤组[(14.8±0.7)pg/200 mg,P＜0.01],6 h达高峰,以后逐渐下降,伤后24 h仍明显高于假伤组(P＜0.01);伤后3～24 h.小剂量治疗组AⅡ含量均明显高于假伤组(P＜0.05或P＜0.01),但均低于烫伤组.伤后6 h烫伤组AⅡ含量为(145.2±14.5)pg/200 mg,高于小、中、大剂量治疗组[(65.1±0.9)、(53.6±1.1)、(34.2±0.9)pg/200 mg,P ＜0.01].结论 严重烫伤后早期心肌组织损害明显.心功能即明显下降,依那普利托注射液可以改善心肌力学指标、保护心功能,以小剂量效果最为明显.     

甘氨酸对重度烧伤后大鼠早期心肌组织的保护作用观察

目的探讨甘氨酸对烧伤后早期心肌组织的保护作用.方法 Sprague Dawley(SD)大鼠44只随机分为对照组、烧伤组、甘氨酸处理组,其中烧伤组腹腔注射生理盐水(每1%烧伤面积4.0 ml/kg),甘氨酸处理组腹腔注射甘氨酸(1 g/kg).在大鼠30%总体表面积(total body surface area, TBSA) Ⅲ度烧伤后1、3、6、12和24 h检测血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白I(TnI)的含量变化.结果烧伤后3 h开始血浆中LDH、CK较对照组均明显升高(P<0.01),烧伤后1 h开始血浆中TnI较对照组明显增高(P<0.01);而甘氨酸处理后血浆中LDH、CK、TnI含量均较烧伤组明显减少(P<0.01).结论甘氨酸减少心肌组织LDH、CK、TnI的释放,发挥了其对心脏的保护作用.     

烧伤早期大鼠心肌线粒体DNA 4.8 kb大片段缺失的检测及其意义

目的观察严重烧伤早期大鼠心肌组织线粒体DNA(mtDNA)4．8kb大片段缺失的规律,探讨线粒体参与烧伤后“休克心”形成的基本机制。方法Sprague Dawley(SD)大鼠36只随机分为假烫伤组、30％TBSA Ⅲ度烫伤1、3、6、12、24h组,半定量PCR法检测烧伤前后心肌线粒体DNA缺失率,并测定各组大鼠心肌线粒体中ATP、ADP、AMP以及血清中肌钙蛋白I(Tn I)含量变化。结果①大鼠烧伤后1、3、24h分别发生了线粒体DNA(mtDNA)的部分或全部4．8kb大片段缺失。②大鼠烧伤后1、3、6、24h时心肌线粒体中ATP含量下降,结果有显著性意义(P＜0．05,P＜0．01)。、③大鼠烫伤后血清中Tn I含量急剧上升,至伤后6h达最高峰,变化有显著性意义(P＜0．05,P＜0．01)。结论烧伤早期心肌mtDNA发生了严重缺失,可能诱发线粒体氧化磷酸化障碍,促进了烧伤早期心肌损伤。     

双链小片段干扰RNA抑制缺氧条件下乳鼠心肌细胞缺氧诱导因子1α表达

目的　构建含缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)小片段干扰RNA(siRNA)靶序列的U6启动子表达框结构 ,观察其对缺氧条件下乳鼠心肌细胞HIF 1α表达的影响。　方法　分离培养乳鼠心肌细胞 ,分为常规培养液对照组、RNA干扰 (RNAi)组 (转染无效干扰序列Ⅳ )、RNAi抑制组 (转染有效干扰序列并按下游引物不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组 )。设计、合成 3对 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ )含HIF 1α编码基因片段(正、反义 )和 1对 (Ⅳ )随机序列 (正、反义 )的PCR下游引物。PCR法构建U6启动子表达框及相应正、反序列表达框 ,同时转染心肌细胞。每组每时相点 5皿细胞。于缺氧 1h后 ,用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定其蛋白水平表达 ,免疫组织化学法检验干扰效果。缺氧 6h后采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法检测HIF 1αmRNA的表达。　 结果　筛选出的最佳抑制片段为Ⅱ组序列。缺氧 1h,对照组、RNAi组心肌细胞HIF 1α蛋白水平显著增高 ,Ⅰ、Ⅱ、ⅢRNAi抑制组HIF 1α蛋白水平较对照组明显降低 ,其中Ⅱ组降低最为显著 (P <0.0 1);缺氧 6h,RNAi组心肌细胞HIF 1αmRNA水平较常氧条件下明显增高 (P <0.0 1);RNAi抑制Ⅱ组未见明显增高 (P >0.0 5 )。　 结论　构建的HIF 1αⅡ组表达框能有效地抑制缺氧乳鼠心肌细胞HIF 1α表达     

p38丝裂原活化蛋白激酶途径在大鼠严重烧伤后早期心肌膜磷降解中的作用

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径在严重烧伤后早期心肌胞质型磷脂酶A2（cPLA2）表达及膜磷脂降解中的作用。方法将Wistar大鼠分为：正常组（8只）、单纯烧伤组（40只）、烧伤＋SB203580组（16只）和烧伤＋等渗盐水组（16只）。后3组大鼠制成40％TBSAⅢ度烧伤模型，后2组按实验设计分别注射p38MAPK抑制剂SB203580或等渗盐水。单纯烧伤组设5个时相点，其余烧伤组设2个时相点，每时相点8只。检测各组大鼠心肌cPLA2 mRNA表达和膜磷脂含量变化。缺氧复合烧伤血清处理体外培养的大鼠心肌细胞，观察SB203580对其cPLA2 mRNA表达的影响。结果单纯烧伤组大鼠伤后各时相点cPLA2 mRNA表达显著高于正常组的0．280±0．020，伤后3h达峰值；单纯烧伤组大鼠心肌膜磷脂含量伤后即降低，6h达最低值[（0．052±0．017）mg磷／mg蛋白]。烧伤后心肌cPLA2 mRNA表达与膜磷脂含量呈显著负相关（r=-0．53，P＜0．05）。与烧伤＋等渗盐水组比较，伤后6、12h烧伤＋SB203580组大鼠心肌磷酸化p38MAPK水平显著降低，cPLA2 mRNA表达仅为该组的72％、51％（P＜0．01），心肌膜磷脂含量也显著高于该组。此外，SB203580也显著降低了缺氧复合烧伤血清处理的离体大鼠心肌细胞cPLA2 mRNA的表达水平。结论p38MAPK途径在大鼠严重烧伤后早期心肌膜磷脂降解中起重要作用，其机制可能与磷酸化p38MAPK上调心肌cPLA2 mRNA表达水平有关。     

成体大鼠心肌细胞微管解聚对线粒体分布及能量代谢的影响

目的 了解成体大鼠心肌细胞微管解聚对线粒体分布、线粒体活性及细胞能量代谢的影响. 方法 分离培养成体SD大鼠及SD大鼠乳鼠心肌细胞,按随机数字表法分为:大(乳)鼠对照组(常规培养,不加任何刺激因素)、大(乳)鼠微管解聚剂组(用含终浓度8μmol/L秋水仙碱的培养液培养,作用30 min).(1)用蛋白质印迹法检测各组大鼠和乳鼠心肌细胞聚合态β微管蛋白表达量.(2)取2组大鼠心肌细胞,用蛋白质印迹法检测细胞色素c表达量;免疫荧光染色法观察细胞聚合态β微管蛋白、电压依赖型阴离子通道(VDAC)分布情况;免疫细胞化学法检测细胞线粒体内膜电位;噻唑蓝法测量细胞活性;采用高效液相色谱法,检测细胞ATP、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷一磷酸(AMP)含量及能荷. 结果 (1)聚合态β微管蛋白表达量:大鼠微管解聚剂组为0.52±0.07,较大鼠对照组1.25±0.12明显减少(F=31.002,P=0.000);乳鼠微管解聚剂组为0.76±0.12,较乳鼠对照组1.11±0.24显著减少(F=31.002,P=0.000),但明显高于大鼠微管解聚剂组(F=31.002,P=0.009).(2)细胞色素c表达量:大鼠对照组为0.26±0.03,明显低于大鼠微管解聚剂组(1.55±0.13,t=-24.056,P=0.000).(3)免疫荧光染色:大鼠对照组心肌细胞微管多呈线性管状、与心肌纤维平行分布;VDAC着色显示线粒体呈颗粒状与微管同向分布.大鼠微管解聚剂组微管正常排列规律被破坏,表现为免疫荧光强度减弱,微管结构不清晰、连续性丧失、粗糙;线粒体分布散乱.(4)线粒体内膜电位:大鼠对照组荧光强度为1288±84,明显高于大鼠微管解聚剂组(331±27,t=26.508,P=0.000).(5)细胞活性:大鼠对照组吸光度值为1.75±0.11;大鼠微管解聚剂组为0.81±0.07,较前者明显降低(t=17.348,P=0.000).(6)能量代谢:与大鼠对照组比较,大鼠微管解聚剂组心肌细胞ATP含量下降,ADP、AMP含量上升,ATP/ADP值与能荷均降低. 结论 在正常成体大鼠心肌细胞内,微管与线粒体分布方向一致.微管解聚后心肌细胞线粒体排列紊乱,细胞色素c从线粒体漏出,线粒体内膜电位下降、能量供应降低,细胞活性下降.     

微管解聚与心肌细胞缺氧性损害的实验研究

目的观察缺氧引起的心肌细胞微管解聚是否能导致细胞线粒体通透性转换孔开放,降低细胞活性,引起细胞缺氧性损害.方法将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为对照(常氧)组(A组)、缺氧组(B组)、常氧 微管解聚剂组(C组)、缺氧 微管稳定剂组(D组).检测各组0.5、1、3、6、12 h微管免疫荧光,了解微管结构变化,以免疫印迹(Western blot)法半定量分析聚合态微管蛋白变化,用酯化钙黄绿素和氯化钴共孵育的方法检测线粒体通透性转换孔开放,用MTT法测定细胞活性.结果 B组和C组聚合态微管在缺氧0.5 h后即发生明显破坏,同时能观察到线粒体通透性转换孔开放和细胞活性下降,且随着缺氧时间的延长,以上现象愈发显著.而同一时相点D组聚合态微管被破坏程度、线粒体通透性转换孔开放情况和细胞活性下降均明显轻于B组.结论缺氧可引起心肌细胞聚合态微管明显破坏,导致细胞线粒体通透性转换孔开放,进而影响细胞活性,引起细胞缺氧性损害.微管解聚剂能较好地模拟缺氧引起的微管破坏作用,导致细胞活性下降,而微管稳定剂能有效减轻缺氧引起的微管破坏,保护细胞活性,明显减轻心肌细胞的缺氧性损害.