特发性脊柱侧凸患者椎旁肌中神经营养素3的表达及意义

目的:研究特发性脊柱侧凸(IS)患者椎旁肌组织中神经营养素3(Neurotrophin-3,NT-3)在核酸水平(mRNA)的表达情况。方法:随机选择19例IS患者,年龄12～19岁,平均14.3岁,Cobb角42°～80°(平均54°)。手术中取顶椎(T7～T10)凸侧、凹侧椎旁肌肉组织,采用半定量RT-PCR法检测NT-3 mRNA表达水平。取4例相同年龄段的椎间盘突出患者手术切口头端非病变部位椎旁肌肉组织作为对照。结果:对照组椎旁肌中NT-3的mRNA表达阳性率50%,相对表达量为0.0237±0.0158,IS组患者椎旁肌中表达阳性率63.16%,相对表达量为0.1213±0.0939,较对照组表达量增加(P=0.051)。9例Cobb角>50°的IS患者表达阳性率为44.44%,相对表达量0.0431±0.0359,和对照组无明显差异;10例Cobb角≤50°的IS患者中表达阳性率为80%,相对表达量为0.1604±0.0895,与对照组和Cobb角>50°的IS患者比较有明显增加(P<0.01)。结论:正常椎旁肌组织中NT-3在核酸水平微量表达,特发性脊柱侧凸患者椎旁肌组织中NT-3 mRNA表达增加,尤其在小角度IS患者中增加明显,提示IS患者中存在神经营养因子表达异常。     

Lipofectamine TM2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验研究

目的构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,检测其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况。方法构建含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3后,在阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导下将其转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织,转染后24 h,通过Confocal显微镜观察小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况和转染效率。结果成功构建了真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,通过阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导,该质粒在新生小鼠离体耳蜗基底膜转染的范围内转染进17个细胞,说明该质粒在阳离子脂质体介导下能转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3的成功构建,及其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的有效转染,为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

T细胞特异性转录因子T-bet、GATA3调控子(癎)前期辅助性T淋巴细胞1型免疫漂移的研究

子(癎)前期是产科常见且严重的妊娠并发症,是导致围产儿及孕产妇死亡的重要原因[1].研究发现辅助性T淋巴细胞1和2(T helper 1/T helper 2,Th1/Th2)免疫状态向Th1漂移是子(癎)前期发病的重要免疫机制[1-4],因此研究子(癎)前期产生Th1型漂移的免疫调控机制有助于进一步了解其病理生理机制,目前国内外尚未见相关研究报道.     

用猪AMI模型研究荧光染料CFSE和Brdu作为移植细胞标记物的实用性

目的研究荧光染料CFSE和Brdu作为体内细胞移植标记物的实用性.方法构建猪急性心肌梗死(AMI)模型.用CFSE和Brdu对骨髓单个核细胞进行双标记,经冠状动脉回输至MI区.4周后,利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的定位和标记情况.结果细胞移植4周后,发现Brdu阳性细胞多位于心肌疤痕形成区且MI区的新生血管内壁也出现阳性染色.在MI区可见CFSE标记的带绿色荧光的细胞,但背景色较高.结论在动物实验中,CFSE和Br-du均可作为移植细胞标记物,Brdu的标记效果优于CFSE,适于同时进行形态学和组织学研究.     

人宫颈癌基因表达载体的构建及其在肝癌相关研究中的价值

目的 为人宫颈癌基因(HCCR)在肝癌发生、发展中的生物学效应及机制研究提供理想工具.方法 培养人HepG2细胞,RT-PCR扩增出HCCR基因片段,将其连接到pCR T7 TOPO TA/NT克隆载体中,命名为pCR T7 TOPO TA/NT-HCCR.运用交叉引物PCR筛选正确连接的克隆.再用EcoR I和BamH I限制性内切酶酶切鉴定和测序验证.将其转化BL21细菌,用IPTG诱导其表达相应的蛋白质,并用Western blotting验证.结果 pCR T7 TOPO TA/NT-HCCR原核表达载体构建成功.酶切鉴定和测序均与预期一致.用IPTG诱导转化此质粒后的BL21细菌,得到相应大小的蛋白质.结论 pCR T7 TOPO TA/NT-HCCR 原核表达载体构建成功;其可作为HCCR基因功能研究及其与肝癌相关性研究的理想工具.     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯化,前者回收1065bp片断,后者回收大片断,再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接,转化感受态DH5α细胞,挑选单克隆,提取质粒,将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK293T细胞,观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,该质粒能有效地转染HEK293T细胞,目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达术

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板，经PCR获得Hath1-cDNA，将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoI、EcoRI双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化，前者回收1065bp片断，后者回收大片断，再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5q细胞，挑选单克隆，提取质粒，将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体Lipofectarnine^TM2000转染HEK293T细胞，观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，该质粒能有效地转染HEK293T细胞，目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

RNA干扰和伊马替尼杀伤K562细胞效果的比较

目的比较RNA干扰（RNAi）和伊马替尼（imatinib）杀伤K562细胞的效果。方法设计有效的bcr—abl干扰shRNA序列，利用基因工程技术插入到干扰载体构建RNAi质粒。测序鉴定正确的RNAi质粒转染K562细胞，48h后荧光显微镜观察转染效率。RT—PCR技术检测K562细胞中bcr—abl表达水平。同时，伊马替尼作用K562细胞。利用凋亡分析、MTT增生实验和磷酸化的酪氨酸蛋白含量检测来评估RNAi和伊马替尼作用效果。结果与伊马替尼一样，RNAi使K562细胞凋亡增强，增生减少，磷酸化的酪氨酸蛋白含量减少。结论RNAi达到伊马替尼杀伤K562细胞的效果，有望在临床用于治疗慢性髓细胞白血病（CML）患者，尤其是那些对伊马替尼等化疗药物不敏感的CML患者。