超声介导上调Smad7表达对腹膜炎大鼠腹膜炎症和功能的影响

目的 通过基因转染的方法上调Smad7在大鼠腹膜组织的表达，旨在探讨Smad7的高表达对大鼠腹膜炎模型的炎症反应和腹膜功能的影响。方法 Ⅱ级雄性SD大鼠18只随机分入正常组、对照组和模型组，后两组分别给予空载体和Smad7质粒转染，72 h后腹腔内注射大肠杆菌(E.Coli, ATCC 25922) 10⁹ CFU/kg体重诱导腹膜炎，在48 h后做腹膜功能试验并杀检大鼠。检测腹水及血白细胞计数、腹水细菌菌落计数。间接免疫荧光检测Smad7和CD45在腹膜组织的表达。Western印迹检测腹膜组织Smad7蛋白的表达。应用SPSS 11.0统计软件对腹膜功能与腹水白细胞数和细菌菌落数进行Pearson多元线性相关分析。 结果 与空载体组比较，Smad7转基因组大鼠腹膜组织Smad7的表达、腹水白细胞计数和腹膜组织浸润的白细胞数均显著增加，但腹水细菌菌落计数显著降低、腹膜功能显著恶化。相关分析显示腹膜功能的恶化与腹水白细胞计数相关而与腹水细菌菌落计数无相关。结论 Smad7在大鼠腹膜组织的高表达增强了腹膜局部的炎症反应，而过强的炎症反应导致腹膜功能进一步受损。     

转化生长因子β1及其信号蛋白在大鼠急性腹膜炎模型腹膜组织中的表达及作用

目的 通过观察转化生长因子β1(TGF-β1)及其信号蛋白Smads的表达水平和活性状况,探讨其在细菌性腹膜炎介导腹膜纤维化过程中的可能作用。方法 通过腹腔注射E.coli ATCC25922造成大鼠急性细菌性腹膜炎的动物模型。应用激光共聚焦显微镜检测TGF-β1、p-Smad2／3和Smad7在大鼠腹膜组织的表达和活化,以单位面积的平均荧光强度半定量地分析其蛋白水平的表达及动态变化。应用RT-PCR的方法分析TGF-β1、Smad3和Smad7在基因水平的表达。结果 E.coli腹腔注射后大鼠血白细胞显著降低而腹水白细胞显著升高。组织学显示间皮下层水肿样增厚,脏层和壁层腹膜大量炎症细胞灶性浸润。免疫荧光结果显示TGF-β1和p-Smad2／3广泛表达于炎症细胞、间皮细胞和血管内皮细胞。半定量的免疫荧光结果显示TGF-β1、p-Smad2／3和Smad7的表达都呈双峰样上调,但Smad7的整体表达水平一直很低。TGF-β1、Smad3和Smad7 mRNA的表达水平与其蛋白表达水平基本一致。结论炎症状态下腹膜组织TGF-β1／Smad信号通路显著上调和激活。腹膜间皮细胞的活化以及其TGF-β1和p-Smad2／3的高表达,抑制性信号蛋白Smad7的低表达,可能参与了腹膜炎介导腹膜纤维化的过程。     

上调Smad7表达对腹膜纤维化大鼠腹膜炎症细胞浸润及促炎症因子表达的影响

目的 研究基因转染上调Smad7表达对大鼠腹膜纤维化模型腹膜炎症细胞浸润及促炎症因子表达的影响。方法 48只SD大鼠随机分为（1）正常对照组（n=12）；（2）模型组（n=12）：每日给予腹腔注射4．25％葡萄糖腹膜透析液（100ml／kg），同时于第8、10、12、22、24、26天腹腔注射脂多糖（LPS，0．6mg／kg）；（3）空白载体对照组（n=12）：仅转入不含Smad7的Tet-on／vector空白载体；（4）Smad7基因转染组（n=12）：在造模后第0、14天分别转染Smad7。第28天时杀检，分别应用免疫荧光染色及RT-PCR检测脏层腹膜泛白细胞标志性抗原（OX-1）、单核巨噬细胞抗原（ED-1）、白介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）蛋白和mRNA的表达水平。Smad7基因转染采用超声介导的微泡基因转染技术。结果 与模型组及空白载体转染组比较．Smad7转基因组脏层腹膜OX-1、ED-1阳性细胞以及IL-1、TNF-α表达水平有明显的减少，但均高于正常对照组。结论 高糖腹膜透析液联合LPS可刺激腹膜炎症细胞的浸润及腹膜间皮细胞IL-1、TNF-α表达上调。基因转染上调Smad7表达可明显抑制大鼠腹膜纤维化模型腹膜炎症细胞浸润及促炎症因子的表达上调。     

抗生素治疗对急性腹膜炎大鼠腹膜组织炎症因子表达及腹膜转运功能的影响

目的：观察抗生素治疗对急性腹膜炎大鼠腹膜组织炎症因子的表达及腹膜功能的影响，并初步探讨其影响机制。 方法： SD雄性大鼠随机分为3组：对照组（n=28）腹腔注射PBS 50 mL·kg－1；腹膜炎组（n=28）腹腔注射E.coli 33×108 cfu·kg－1；治疗组（n=28）腹腔注射E.coli 33×108 cfu·kg－1，并于3 h、9 h腹腔注射庆大霉素10 mg·kg－1。在24 h、48 h、72 h、7 d分别处死7只大鼠，处死前4 h做PET，取腹水、血做细菌培养及白细胞计数，取腹膜组织做病理及NF-κB、CD45、IL-1β、TNF-α的检测。 结果： （1）对照组细菌培养阴性，腹膜炎组在24 h、48 h、72 h阳性，治疗组在24 h、48 h阳性；腹膜炎组血白细胞在24 h、48 h显著低于对照组，治疗组血白细胞未见显著变化；腹膜炎组腹水白细胞从24 h到72 h均显著高于对照组，治疗组在24 h、48 h显著高于对照组，并且在24 h显著高于腹膜炎组。（2）活化NF-κB、IL-1β、TNF-α、CD45在对照组为阴性或微弱表达，在腹膜炎组和治疗组从24 h至72 h均显著高表达，但治疗组在48 h、72 h显著低于腹膜炎组；IL-1β、TNF-α mRNA水平和蛋白表达相一致。（3）腹膜炎和治疗组的超滤量和D/D0 Glu均显著低于对照组，D/P TP均显著高于对照组；治疗组的超滤量及D/D0 Glu和腹膜炎组比较无显著差异，但D/P TP显著低于腹膜炎组。 结论： 有效抗生素治疗可以部分降低腹膜炎大鼠腹膜组织炎症因子的表达，并部分改善腹膜对蛋白的转运功能，但不能有效改善对液体的超滤和葡萄糖的转运功能。     

上调Smad7表达对大鼠腹膜纤维化模型腹膜间皮细胞转分化的影响

目的 探讨上调Smad7表达对腹膜纤维化大鼠模型腹膜间皮细胞转分化的影响，为进一步研究防止腹膜纤维化的措施提供依据。 方法 将24只体重180~200 g SD雄性大鼠随机分为4组:A组(6只):正常对照组；B组(6只):腹膜纤维化模型组，每日按100 ml/kg腹腔注射4.25%透析液，并于造模后第8、10、12、22、24、26天按0.6 mg/kg腹腔注射脂多糖(LPS)；C组(6只):空白载体组，在建立模型的第1、14天转染空白载体和pEF purop-Tet-on质粒；D组(6只):Smad7转染组，在建立模型第1、14天转染Smad7和pEF purop-Tet-on质粒。各组均在每日饮水中加入强力霉素(200 mg/L)诱导基因表达。所有动物于实验第28天杀检，取脏层腹膜组织行光镜及电镜检查。用RT-PCR、间接免疫荧光和Western印迹方法检测α-SMA、E-钙黏蛋白(cadherin)、Smad7、磷酸化(P)-Smad2/3 mRNA和蛋白表达。 结果 与正常对照组比较，腹膜纤维化模型组和空白载体组p-Smad2/3蛋白水平显著升高，α-SMA mRNA和蛋白表达上调，但E-cadherin mRNA和蛋白水平明显下调。电镜结果显示，腹膜纤维化模型组和空白载体组腹膜间皮细胞微绒毛脱落，基底膜断裂，并向间皮下组织迁徙，胞浆中有密体、密斑和肌丝出现。与上述2组比较，Smad7基因转染组Smad7蛋白表达明显增加，p-Smad2/3蛋白水平明显下调，α-SMA mRNA和蛋白水平也明显降低，而E-cadherin mRNA和蛋白水平无明显变化。电镜结果显示，Smad7基因转染组腹膜间皮细胞微绒毛明显增多，细胞连接和基底膜趋于完整。 结论 基因转染上调Smad7表达可通过部分抑制TGF-β受体调控信号通路(Smad2/3)，抑制腹膜间皮细胞向肌成纤维细胞的转分化。     

一种新的大鼠慢性腹膜纤维化动物模型的建立

腹膜纤维化是长期腹膜透析患者常会出现的并发症,它可导致腹膜结构和功能丧失,是患者退出腹膜透析的主要原因之一。有研究表明腹膜透析液中的高糖、低pH值及反复发生的腹膜炎是导致腹膜纤维化的主要原因。目前,国内外尚无一个公认的符合临床病理生理过程的慢性腹膜纤维化模型。因此本实验的目的就是探讨建立一个能反映慢性腹膜纤维化发生发展过程的腹膜纤维化动物模型,为进一步研究腹膜纤维化的发生机制及其防治奠定基础。     

终末期糖基化终产物通过转化生长因子依赖和非依赖途径介导NRK52E细胞转分化和胶原Ⅰ的合成

目的探讨终末期糖基化终产物（AGEs）介导肾小管上皮细胞转分化和胶原（Col）Ⅰ合成的分子机制。方法体外培养正常大鼠近端肾小管上皮细胞系（NRK52E），应用自制的AGE-牛血清白蛋白（BSA）刺激NRK52E细胞。免疫细胞化学方法检测不同时间磷酸化（P）Smad2／3核转位情况。ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β1的水平。RT-PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙黏着糖蛋白（cadherin）和ColⅠmRNA表达。Western印迹检测α-SMA、E-cadherin和ColⅠ蛋白的表达。同时观察TGF-β1中和抗体对AGE-BSA上述效应的阻断作用。结果基础状态下，NRK52E细胞存在低水平p-Smad2／3核表达（16％）。与BSA对照组比较，AGE—BSA以时间依赖方式上调NRK52E细胞p-Smad2／3核转位，其高峰出现在30min（68％比30.5％，P〈0．01）和24h（76％比31．3％，P〈0．01）。AGE—BSA显著上调α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达；下调E-cadherin mRNA和蛋白的表达；并能促进NRK52E细胞合成和分泌TGF-β1。TGF-β1中和抗体能明显抑制AGE—BSA介导的24hp-Smad2／3核转位（25．2％，P〈0．01），但不能阻抑30min活化高峰；能明显抑制AGE-BSA介导的α-SMA和ColⅠmRNA和蛋白表达．以及显著地上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。结论AGEs通过TGF-β依赖和非依赖途径诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进其向肌成纤维母细胞转分化和ColⅠ的合成。     

大鼠急性腹膜炎模型的建立及其对腹膜功能的影响

目的建立稳定的大肠杆菌诱导的大鼠急性腹膜炎模型,并观察急性细菌性腹膜炎对腹膜功能的影响.方法雄性SD大鼠60只,体重180～230 g,随机分为6组,每组10只,对照组给予腹腔注射50 ml/kg磷酸盐缓冲液(PBS),其余5组分别按体重给予大肠杆菌ATCC25922 3.3×106、3.3×107、3.3×108、3.3×109、3.3×1010cfu/kg腹腔注射,观察大鼠一般情况及死亡率,并在72h杀检,做腹水白细胞计数及腹膜HE染色.另取SD雄性大鼠130只,体重180～230 g,随机分为两组,对照组63只,灭菌PBS腹腔注射;腹膜炎组63只,腹腔注射大肠杆菌ATCC25922 3.3×108cfu/kg体重,分别于0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d、21 d各杀检7只大鼠,24 h、48 h、72 h、7 d、21 d在杀检前4小时做腹膜平衡试验,并留取腹膜组织做Masson染色及泛白细胞抗原CD45免疫荧光检查.结果(1)随着腹腔注射大肠杆菌剂量的增高,注射后模型组的死亡率逐渐增高(0、10%、10%、50%、100%),其中3.3×108组腹膜炎症状较重,但死亡率较低(10%).(2)模型组外周血白细胞3 h即降低,72 h后回升到正常水平,粒细胞在3 h显著下降,12 h显著回升,之后再次下降,并在24 h、48 h、72 h持续处于较低水平,7 d回复正常;腹水白细胞总数3h开始升高,24 h达高峰,7 d回复正常,腹水中性粒细胞在48 h达到高峰,7d回复到对照组水平;腹水单核细胞在24 h显著增高,72 h回复到对照组水平;腹膜组织炎症细胞呈弥漫性分布,72 h最为显著,7 d回复正常.(3)模型组净超滤量显著下降,D/D0葡萄糖显著降低,D/P总蛋白显著增高.结论大肠杆菌ATCC25922在3.3×108cfu/kg体重是诱导大鼠急性腹膜炎模型的较佳剂量.急性腹膜炎对腹膜的超滤功能及蛋白和葡萄糖的转运功能影响显著.     

AGEs对肾小管上皮细胞转分化、1型胶原合成及smad信号通路的影响

目的:观察终末期糖基化终产物(AGEs)对正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E ）转分化、collagenⅠ合成及Smads信号通路的影响。 方法:应用自制的AGEs（AGE-BSA）刺激NRK52E细胞，采用免疫细胞化学方法检测pmad2/3核表达情况；ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β₁的浓度；RT-PCR检测TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；Western印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙粘着糖蛋白（cadherin）和1型胶原（collagenⅠ）蛋白的表达。 结果: AGE-BSA刺激15 min后pSmad2/3核表达明显增加，于30 min（68%）和24 h（76%）出现两个高峰，与刺激前及时间匹配的BSA对照组比较均有显著差异（P<0.05）；AGE-BSA以时间依赖方式上调TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；NRK52E细胞α-SMA和collagenⅠ蛋白表达高于对照组（P<0.01），E-cadherin蛋白表达低于对照组（P<0.01），细胞上清液TGF-β₁的浓度高于对照组（P<0.01）。 结论:AGEs可诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质collagenⅠ的合成。