靶向Notch1基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定靶向Notch1基因的siRNA真核表达载体。方法：根据Notch1基因cDNA序列，设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列，将其插入U6启动子下游，克隆到真核表达载体pGsensil中，并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中，荧光下观测转染效率。RT-PCR检测Notch1基因mRNA在转染前后的表达。结果：转染48h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notch1 mRNA的表达。酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论：成功构建的靶向Notch1的siRNA真核表达载体，具有抑制Notch1基因mRNA表达的功能，可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向。     

膀胱移行细胞癌错配修复基因hMLH1、hMSH2、hMSH3启动子甲基化状态的研究

目的 探讨错配修复基因hMLH1、hMSH2、hMSH3在膀胱移行细胞癌中启动子甲基化和蛋白表达的相关性.方法 采用甲基化特异聚合酶链反应(MSP)检测正常膀胱上皮组织(13例)及膀胱移行细胞癌组织(57例)hMLH1、hMSH2、hMSH3启动子甲基化状态,免疫组织化学检测其蛋白表达.结果 在正常膀胱上皮中,hMLH1、hMSH2、hMSH3均未发现启动子甲基化;在肿瘤组织中,hMSH2未发现启动子甲基化,hMLH1、hMSH3启动子甲基化阳性率分别为36.8%、49.1%,与正常组织比较差异均有统计学意义(P＜0.01),但在不同肿瘤分级(G1、G2、G3)间及不同临床分期(浅表性、浸润性)间比较差异无统计学意义(P＞0.05).免疫组织化学显示:hMLH1、hMSH2、hMSH3蛋白表达在正常膀胱上皮组织中,阳性表达率分别为100%、100%、92.3%,与肿瘤组织阳性表达率分别为59.6%、52.6%、40.4%,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01),但在不同临床分期(浅表性、浸润性)间比较差异无统计学意义(P＞0.05),且hMSH2、hMSH3蛋白阳性表达率随肿瘤分级的增加显著降低,G1与G3比较差异有统计学意义(P＜0.05).在肿瘤组织中,hMLH1和hMSH3启动子甲基化与蛋白表达具有极显著相关性(P＜0.01).结论 hMLH1、hMSH3蛋白表达受其启动子甲基化的调控,hMSH2蛋白表达不受其启动子甲基化的调控.错配修复基因hMLH1、hMSH2、hMSH3蛋白表达的缺失可能参与了膀胱移行细胞癌的发生.     

DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒转染对人膀胱癌细胞DNMTs表达的影响及其生物学效应

目的：探讨DNMT1、DNMT3b基因在膀胱癌发生发展中的作用。方法：①将DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒分别单独和共同转入人膀胱癌细胞系Nu87;②半定量RT—PCR和WesternBlot分别检测DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白水平的变化;③用MTT法观察各组细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果：单独和共同转染DNMT1（或DNMT3b）mRNA、蛋白表达量明显下降,能影响BIU一87的生长曲线,使细胞增殖减慢,并使细胞周期阻滞于G1期,明显提高细胞调亡率;转染空质粒和单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。结论：联合转染DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒,可同时下调DNMT1和DNMT3b在BIU87细胞中的表达,并能在体外抑制BIU-87细胞生长,促进细胞凋亡发生,其效果优于单独转染的重组质粒。单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。     

DNMT1和DNMT3b基因在人膀胱癌组织和细胞中的表达及意义

目的 探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)和DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)在人膀胱癌组织和人膀胱癌细胞系BIU-87中的表达及意义.方法 用免疫组织化学法分别检测DNMT1和DNMT3b蛋白在24例膀胱癌组织和10例正常膀胱组织中的阳性表达率;用RT-PCR和Western blot分别检测DNMT1和DNMT3b基因在人膀胱癌细胞系BIU-87中mRNA表达水平和蛋白表达水平.结果 在24例膀胱癌组织中,DNMT1阳性表达率为(75.29±2.51)%,而在10例正常膀胱组织中的阳性表达率为(12.61±1.57)%,二者之间的差异具有显著性意义(P<0.05);DNMT3b在24例膀胱癌组织中的阳性表达率为(70.91±2.86)%,在10例正常膀胱组织中的阳性表达率仅为(10.16±1.22)%,二者差异亦具有显著性意义(P<0.05);在人膀胱癌细胞系BIU-87中,通过RT-PCR和Western blot均检测到DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白的表达.结论 在膀胱癌组织中,DNMT1和DNMT3b蛋白的表达较正常膀胱组织明显增加,说明DNMT1和DNMT3b的高表达可能与膀胱癌的发生发展有关;DNMT1和DNMT3b在人膀胱癌细胞系BIU-87中存在表达.     

microRNA-34a的表达对膀胱癌细胞系J82生物学行为的影响

目的:探讨microRNA-34a(miR-34a)的外源性表达对人膀胱癌J82细胞生物学行为的影响。方法:将miR-34a表达质粒或对照质粒转染J82细胞,实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-34a在转染细胞中的表达水平,细胞计数法、流式细胞术、Transwell侵袭实验分别检测外源性miR-34a表达后J82细胞增殖、凋亡、周期和侵袭能力的变化情况。结果:miR-34a表达质粒组与对照组比较,其miR-34a表达诱导性升高(P=0.002 6),细胞增殖受到抑制(P=0.000 1),细胞凋亡率增加(1.237%±0.116%vs 5.497%±0.293%;P<0.000 1),细胞周期阻滞于G0～G1期(54.510%±1.501%vs 62.200%±0.754%;P=0.001 5);细胞侵袭能力降低,(65.01±11.79)vs(34.33±9.71),P=0.025 4。结论:在膀胱癌J82细胞中增加miR-34a的表达,可抑制细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡和周期阻滞,并通过影响上述细胞生物学行为降低肿瘤细胞恶性度,miR-34a在膀胱癌细胞系中发挥潜在的抑癌基因作用。     

靶向Notchl基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向Notchl基因的siRNA真核表达载体.方法:根据Notchl基因cDNA序列,设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列,将其插入U6启动子下游,克隆到真核表达载体pGsensil中,并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定.采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中,荧光下观测转染效率.RT-PCR检测Notchl基因mRNA在转染前后的表达.结果:转染48 h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notchl mRNA的表达.酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确.结论:成功构建的靶向Notchl的siRNA真核表达载体,具有抑制Notchl基因mRNA表达的功能,可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向.     

小儿腹腔镜下巨输尿管成形术

目的 探讨小儿腹腔镜下输尿管铲状乳头膀胱再植术的可行性和临床效果.方法采用经膀胱外途径行腹腔镜下输尿管铲状乳头膀胱再植术治疗先天性梗阻性巨输尿管症患儿11例.年龄11个月～13岁,平均(5.3±3.9)岁.左侧4例,右侧7例.其中输尿管出口闭锁1例、单纯性输尿管出口狭窄9例、开放输尿管膀胱再植术后(Cohen手术)输尿管出口狭窄1例.B超和IVU示重度肾积水7例、中度肾积水4例. 结果 11例手术均获成功.手术时间70～190 min,平均(103.O±35.3)min.术中出血10～40 ml,平均(18.0±9.5)ml.术后住院时间7～10 d,平均(8.0±1.4)d.无尿漏发生.术后6周拔除双J管,膀胱镜或输尿管镜下见膀胱输尿管吻合口已黏膜化,乳头收缩抗反流效果满意;11例平均随访6(3～24)个月,B超复查患侧肾积水减轻;IVU示成形输尿管排尿好,无梗阻,症状基本消失;膀胱造影未见膀胱输尿管反流. 结论 在熟练掌握腹腔镜操作技术后,应用经膀胱外途径腹腔镜下输尿管铲状乳头膀胱再植术治疗小儿梗阻性巨输尿管症创伤小、抗反流效果好,是治疗小儿梗阻性巨输尿管症的微创新途径.     

小儿后腹腔镜输尿管切开取石术及其疗效观察

目的 探讨小儿后腹腔镜输尿管切开取石术的技术要点及临床应用价值.方法 采用后腹腔镜技术行4qL输尿管切开取石术16例,其中9例分别于术前行体外冲击波碎石术(ESWL)、输尿管镜取石术(URL)或二者结合而失败,7例术前未行其他治疗;结石直径1.2～2.2 cm,平均(1.62±0.35)cm.输尿管上段结石12例,输尿管中段结石4例,右侧4例,左侧12例,男11例,女5例.年龄3～14岁,平均7岁.结果 16例患儿取石均成功.手术时间40～150 min,平均(61.31±29.51)min,术中出血量5～25 ml,平均(12.19±7.06)ml;术中无脏器损伤及气体栓塞等严重并发症.患儿均于术后1～2 d恢复饮食和下床活动.3～5 d拔引流管,1周出院,术后漏尿1例.平均随访8个月(3～36个月),患儿肾输尿管积水均明显好转,无结石复发和输尿管吻合处狭窄.结论 小儿后腹腔镜输尿管切开取石术是安全有效的方法,可部分代替传统开放性手术,对于较大的输尿管上段结石可作为首选的治疗方法.