纳米脂质体介导酪氨酸激酶受体3配体基因转染树突状细胞对结肠癌细胞凋亡的作用

目的 观察利用阳性纳米脂质体介导的基因治疗联合免疫治疗对结肠癌细胞的治疗作用.方法 应用基因克隆技术分别构建含有绿色荧光蛋白报告基因的重组质粒(pEGFP),并依据静电吸附原理制备携带基因的阳离子纳米脂质体,再将转染阳性的树突状细胞(DC)移植作用于结肠癌细胞.结果 成功构建含有绿色荧光蛋白报告基因的重组质粒,并得到酶切鉴定和序列测定证实.携带酪氨酸激酶受体3 配体(FL)基因的阳离子纳米脂质体成功转染DC,发现基因在细胞内得到很好表达,且随着培养时间的增加,蛋白表达量有所增加,72h时表达量最高.基因移植后发现对照组肿瘤体积增长最快,FL基因组肿瘤体积增长较慢；FL基因组肿瘤细胞凋亡率和死亡率明显高于对照组(P＜0.05)；而pEGFP组和对照组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 阳离子纳米脂质体作为基因载体具有一定优越性.基因治疗联合免疫治疗在结肠癌治疗中具有重要意义.     

小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化*★

目的：血管重建手术在多数情况下以自体血管作为替代品，但来源有限。胚胎干细胞具有发育全能性，目前其定向诱导机制尚不明确。通过选择适当的诱导剂，探讨胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞分化的趋势。 方法：实验于2006-08/2007-02在南昌大学第二附属医院血液病研究所完成。①动物及细胞系：清洁级孕12.5 d昆明小白鼠1只，由南昌大学医学院动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ编号为SCRC-1018，由American Type Culture Collection提供。②实验方法：取孕12.5 d鼠胚胎，去除头部、内脏及四肢，将组织块剪碎，胰酶消化，分离培养胚胎成纤维细胞，传至3~5代时更换为含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM高糖培养基，24 h后收集培养液，加入2.0 mmol/L L-谷氨酰胺，1×非必需氨基酸，0.1 mmol/L β-巯基乙醇，1 000 Ｕ/mL白血病抑制因子，此即为条件培养基。常规复苏小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ，以1×106密度接种，传代时用差速贴壁法分离去除已分化的胚胎干细胞，加入条件培养基5 mL，经过悬滴-悬浮培养，构建拟胚体分化模型。设立3组，各组均置于明胶包被的T25培养瓶中，每瓶加入50个拟胚体，使其均匀分布于培养瓶底。诱导组7~10 d加入10-9 mol/L全反式维甲酸和3μg/L转化生长因子β1，10~21ｄ加入 20μg/L血小板源性生长因子。血清对照组仅加入去生长因子胎牛血清，全反式维甲酸组仅加入全反式维甲酸。诱导21ｄ的拟胚体，用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ联合消化为单个细胞，再加入20μg/L血小板源性生长因子继续诱导7ｄ。③实验评估：应用RT-PCR法检测诱导细胞血管平滑肌肌动蛋白、血管平滑肌肌球蛋白重链基因的表达。通过免疫细胞化学技术检测血管平滑肌肌动蛋白的表达来鉴定细胞性质。 结果：①胚胎干细胞生长及拟胚体诱导分化：胚胎干细胞在体外能自发形成拟胚体，经过不同生长因子的分阶段联合诱导，拟胚体贴壁后球体略摊开，周围出现大量的梭形细胞。②RT-PCR检测：拟胚体血管平滑肌肌动蛋白和血管平滑肌肌球蛋白重链基因均呈强阳性表达。③免疫细胞化学检测：荧光显微镜下，罗丹明染色细胞浆呈红色荧光，并可见肌丝结构；DAPI染色细胞核呈蓝色荧光。诱导组血管平滑肌肌动蛋白阳性率明显高于血清对照组、全反式维甲酸组（P < 0.05）。 结论：胚胎干细胞经维甲酸、转化生长因子β1以及血小板源性生长因子分阶段联合诱导后，可分化为血管平滑肌细胞且纯度较高。随着细胞纯度和活性等问题的进一步解决，胚胎干细胞将有可能成为血管组织工程的种子细胞。     

小鼠胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞的定向分化

目的:血管重建手术在多数情况下以自体血管作为替代品,但来源有限.胚胎干细胞具有发育全能性,目前其定向诱导机制尚不明确.通过选择适当的诱导剂,探讨胚胎干细胞体外向血管平滑肌细胞分化的趋势.方法:实验于2006-08/2007-02在南昌大学第二附属医院血液病研究所完成.①动物及细胞系:清洁级孕12.5d昆明小白鼠1只,由南昌大学医学院动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ编号为SCRC-1018,由American Type Culture Collection提供.②实验方法:取孕12.5 d鼠胚胎,去除头部、内脏及四肢,将组织块剪碎,胰酶消化,分离培养胚胎成纤维细胞,传至3-5代时史换为含体积分数为0.15胎牛血清的DMEM高糖培养基,24 h后收集培养液,加入2.0mmol/L L-谷氨酰胺,1×非必需氨基酸,0.1 mmol/L β-巯基乙醇,1000 U/mL白血病抑制因子,此即为条件培养基.常规复苏小鼠胚胎干细胞系129X/SvJ,以1 × 106密度接种,传代时用差速贴壁法分离去除已分化的胚胎干细胞,加入条件培养基5 mL,经过悬滴一悬浮培养,构建拟胚体分化模型.设立3组,各组均置于明胶包被的T25培养瓶中,每瓶加入50个拟胚体,使其均匀分布于培养瓶底.诱导组7～10 d加入10-9 mol/L全反式维甲酸和3 μ g/L转化生长因子β1,10～21 d加入20μg/L血小板源性生长因子.血清对照组仅加入去生长因子胎牛血清,全反式维甲酸组仅加入全反式维甲酸.诱导21 d的拟胚体,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ联合消化为单个细胞,再加入20μg/L血小板源性生长因子继续诱导7 d.③实验评估:应用RT-PCR法检测诱导细胞血管平滑肌肌动蛋白、血管平滑肌肌球蛋白重链基因的表达.通过免疫细胞化学技术检测血管平滑肌肌动蛋白的表达来鉴定细胞性质.结果:①胚胎干细胞牛长及拟胚体诱导分化:胚胎干细胞在体外能自发形成拟胚体,经过不同生长因子的分阶段联合诱导,拟胚体贴壁后球体略摊开,周围出现大量的梭形细胞.②RT-PCR检测:拟胚体血管平滑肌肌动蛋白和血管平滑肌肌球蛋白重链基因均呈强阳性表达.③免疫细胞化学检测:荧光显微镜下,罗丹明染色细胞浆呈红色荧光,并可见肌丝结构;DAPI染色细胞核呈蓝色荧光.诱导组血管平滑肌肌动蛋白阳性率明显高于血清对照组、全反式维甲酸组(P＜0.05).结论:胚胎干细胞经维甲酸、转化生长因子β1以及血小板源性生长因子分阶段联合诱导后,可分化为血管平滑肌细胞且纯度较高.随着细胞纯度和活性等问题的进一步解决,胚胎干细胞将有可能成为血管组织工程的种子细胞.     

介入治疗下肢动脉缺血性疾病

目的 评价介入治疗下肢动脉缺血疾病的近、远期疗效.方法 回顾性分析行血管腔内成形术或内支架成形术治疗360例下肢动脉缺血疾病患者的临床资料.结果 本组腔内治疗成功率为93%(335/360),术后静息痛消失、溃疡愈合,术前、后踝眩指数(ABI)分别为0.37±0.16和0.89±0.21,二者比较有显著性差异(P<0.05);25例术后症状无明显改善,其中5例术后1周截肢.312例(86.7%)获得随访,随访时间6个月至8年,术后5年一期通畅率为70%,二期通畅率为82%,糖尿病患者5年一期通畅率为59%,二期通畅率为76%.结论 介入治疗下肢动脉缺血疾病是一种安全有效的治疗方法.     

股浅静脉瓣膜环缩术治疗轻中度股浅静脉返流的前瞻性研究

目的分析股浅静脉瓣膜环缩术在治疗轻中度股浅静脉瓣膜返流中的疗效。方法 32例患者术前彩超均提示股浅静脉返流,下肢静脉逆行造影示Kistner分级为2~3级,随机分为A组和B组各16例,A组行股浅静脉瓣膜环缩+浅静脉手术,B组行浅静脉手术,术后3个月、3年B超检测股浅静脉返流时间,观察患肢症状改善,有无复发及深静脉血栓形成。结果术前A、B两组的返流时间差异无统计学意义(P>0.05),术后3个月及3年A、B两组的返流时间差异均有统计学意义(P<0.05),A组的3年复发率及症状改善明显优于B组。结论股浅静脉瓣膜环缩术在治疗轻中度股浅静脉瓣膜返流中疗效确切,有效地降低了手术复发率,明显地改善了下肢症状。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备及两种不同饲养层的比较

目的探讨建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层，用于胚胎干细胞的培养。方法取孕10．5～18．5d的昆明小鼠胚胎，用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，在体外培养体系中，观察细胞在增殖，传代，冻存及复苏等方面的条件；取购买的小鼠胚胎成纤维细胞系制成饲养层，比较两种细胞用于制备饲养层在胚胎干细胞培养方面的优缺点。结果（1）12．5～14．5d的胎鼠最适合于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，所分离的细胞含杂细胞最少，细胞较多，繁也快；（2）在37℃，0．25％胰酶-0．02％EDTA的混合消化液消化时间最好为3～5min，此时消化下的细胞最多，活力最好；（3）原代细胞平均培养4d即可传代，丝裂霉素-C抑制成纤维细胞增殖的合适浓度为10～20μg／mL（4）原代小鼠胚胎成纤维细胞较小鼠胚胎成纤维细胞系更适合于制备饲养层。结论原代小鼠胚胎成纤维细胞及小鼠胚胎成纤维细胞系均可用于制备饲养层。     

布加综合征的手术治疗及预后分析

目的总结布加综合征手术治疗的基本术式及治疗效果。方法回顾性分析笔者所在医院1994年4月至2013年12月期间收治的1024例布加综合征患者的临床资料,总结布加综合征手术治疗的基本术式及治疗效果。结果 1024例患者中,行外科手术116例,行介入手术908例;行下腔静脉单纯球囊扩张术265例,行下腔静脉球囊扩张加支架置入术464例,行肝静脉开通术97例,行经右心房-股静脉联合破膜球囊扩张支架成形术52例,行肠-腔静脉分流术7例,行根治性矫正术20例,行下腔静脉-右心房人工血管转流术45例,行腔-肠-房联合转流术6例,行腔-肠-颈联合转流术9例,行经颈静脉肝内门-体分流术30例,行肠-房转流术29例。术后获访902例,随访时间为1d-19年,平均13年。严格、灵活地应用各种术式治疗布加综合征为患者带来了令人满意的效果。结论布加综合征由多种原因所引起,其治疗应当根据不同的病因或病理类型而选择不同的治疗方法;对布加综合征的诊断与分型有助于我们制定安全、合理及有效的治疗方案。     

主动脉弓杂交手术治疗主动脉弓分支变异合并主动脉夹层一例

患者男,33岁,因突发腹部及后背部疼痛5 h入院,入院后行主动脉强化CT检查显示:胸主动脉夹层,病变自主动脉弓开始,扩展至降主动脉、腹主动脉、双髂动脉,并累及双锁骨下动脉,破口距左锁骨下动脉开口＜1 cm;主动脉弓分支变异,双颈总动脉共干,右迷走锁骨下动脉;与术中造影相同(图1～3).入院后给予镇静、止痛、控制血压、监测出入量等,于发病2周疼痛缓解后行手术治疗.     

体外定向诱导小鼠胚胎干细胞向内皮细胞分化的研究

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向内皮细胞分化的条件,为组织工程血管提供种子细胞。方法取怀孕12.5d的昆明小白鼠1只,断颈处死,取其胚胎,培养制备小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)。常规复苏ESC后进行体外培养,采用悬滴-悬浮法制备拟胚体(embryoid body,EB)。将EB分两组:实验组加入含有3ng/ml转化生长因子β1、50ng/ml血管内皮细胞生长因子及1μmol/L激活素受体样激酶选择性抑制剂的EB培养基;对照组只加入EB培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况。采用RT-PCR及免疫组织化学染色检测诱导细胞vWF和CD34的表达,验证细胞性质。结果原代MEF生长迅速,第3天细胞融合达90%左右,细胞呈长梭形,有少量侧支,细胞核饱满,有2~3个核仁,细胞排列紧密。传至3~5代,细胞呈多角形,胞浆饱满,有3~4个核仁,细胞表面分泌较多细胞颗粒。ESC在饲养层上保持未分化状态,细胞团形态呈鸟巢样,边缘平整,单个细胞体积小,折光性强,核质比高,增长速度快。悬滴培养3d的EB肉眼可见,再经悬浮培养3d后,形成较大的透亮EB;EB贴壁后第2天,球体略摊开。实验组第4~7天,EB周围有许多圆形细胞产生,第10~14天,可见由大量圆形细胞组成的血管样结构自EB周围生长;对照组EB周围未见血管样结构生长。免疫组织化学染色见EB周围大量vWF染色阳性细胞,RT-PCR检测到vWF和CD34的表达。结论ESC在特定的条件下可以分化为内皮细胞,有可能为组织工程血管提供大量的种子细胞。