SE基因探针的研制及初步应用

过去几年间,基因探针的应用为细菌诊断、分类鉴定及流行病学调查等研究开辟了新的途径。国外学者预言,今后十年用基因探针直接检测临床标本有可能淘汰某些耗物、费时的常规化验。从而为一些不易培养和生化反应不敏感的病原菌的诊断提供数据。     

重组汉坦病毒核壳蛋白的制备及其单克隆抗体的研制

将ＰＣＲ扩增的ＨＴＶ７６－１１８ＲＮＡ小片段的ｃＤＮＡ克隆插入到载体ｐＤＳ５６／ＲＢＳⅡ－（Ｏ）－６Ｈｉｓ中,通过ＩＰＴＧ诱导表达以及镍螯合层析纯化重组ＮＰ,经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫转印和ＥＬＩＳＡ方法分析其蛋白特性,证实该重组ＮＰ与毒粒ＮＰ相同,均为４９．６ｋｕ,能与肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清产生特异性反应。以此重组ＮＰ作为抗原制备抗ＮＰ单克隆抗体,获得两株持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用抗ＮＰＭｃＡｂ建立检测ＩｇＭ抗体的ＥＬＩＳＡ捕获法。证实纯化重组ＮＰ作为抗原,避免了组织培养病毒的感染性和非特异性以及难以标准化的缺点。所建立的ＥＬＩＳＡ捕获法检测ＨＦＲＳ患者血清中ＩｇＭ抗体的方法特异性强、敏感性高,可作为ＨＦＲＳ的早期诊断试剂     

食品中分离的李斯特氏菌的致病基因分析

１９９６—１９９７年作者对全国１２个省市的７类食品共３７４６份进行了李斯特氏菌的污染调查,共分离出李斯特氏菌１６５株。用ＰＣＲ技术对分离菌株中李斯特氏菌的２种主要致病因子李氏溶血素Ｏ和内化素的基因进行了检测,其中５７株仅有内化素基因,２７株同时具有内化素基因和李氏溶血素Ｏ基因。两种致病基因均未检出的共有８１株。本研究说明判断单增李氏菌的主要指标是小鼠毒力试验阳性而不是其溶血反应,同时检测溶血素Ｏ和内化素２种基因对单增李氏菌有鉴别意义。     

鼠疫耶尔森氏菌荧光标记扩增片段长度多态性分型方法

目的 建立荧光标记扩增片段长度多态性(FAFLP)技术平台，探讨鼠疫菌基因分型。方法 用5种核酸限制性内切酶消化鼠疫菌基因组DNA，选择最佳内切酶组合，酶切片段经接头连接后，用荧光素标记的5条EcoRⅠ引物和9条MseⅠ引物组成的引物配对扩增，选择最佳引物组合，进行系列PCR条件的优化。扩增产物经ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(遗传分析仪)检测，GeneScan等软件进行分析。结果 成功建立FAFLP技术平台。结论 FAFLP具有快速、简便、廉价、分辨率高、重复性好和污染少的优点，可用于鼠疫菌的基因分型分析。     

脆弱拟杆菌DNA探针在临床上的应用

目的：在DNA水平上准确鉴定B.fragilis(脆弱拟杆菌）。方法：用脆弱拟杆菌种特异的探针pBF-15与分离株或标本进行DNA点杂交。结果：8株生化鉴定为脆弱拟杆菌的7株经DNA探针证实为脆弱拟杆菌；1株粪拟杆菌、1株吉氏拟杆菌和2株未能鉴定到种的拟杆菌经探针重新鉴定的为脆弱拟杆菌。用pBF-15直接检测了46例临床标本，其结果与常规法符合。结论：DNA探针鉴定脆弱拟杆菌或诊断脆弱拟杆菌感染比常规法准确、快速、简便。     

人格拉利素来源肽段的构效关系研究

目的:研究人格拉利素功能肽段一级结构与活性的关系.方法:依据确定的生物学活性,在人格拉利素功能肽段CM19的基础上,利用抗菌肽的特点及已知的抗菌肽构效关系研究结果对CM19进行氨基酸取代、缺失及随机排列设计合成5条肽段,通过试管法和平板法检测相应肽段的抗菌活性.结果:CM19氨基端第一个半胱氨酸在发挥抗菌作用中是必需的;阳性电荷数的增加或者分布不合适不改善抗菌活性;氨基酸的排列顺序明显降低抗菌活性;CM19羧基端7肽无明显的抗菌作用.CM12具有广谱抗菌作用,不但对非耐药菌而且对耐药菌具有同样的作用.结论:氨基酸的取代、缺失及排列对人格拉利素肽段的抗菌功能具有明显的影响.     

16S rDNA基因芯片检测临床常见感染性细菌

目的 提高细菌和临床微生物检测的速度和准确性，建立含有20种细菌探针在内的感染性细菌检测用基因芯片模型。方法 使用16S rDNA克隆探针和合成的寡核苷酸探针两种，利用点样仪制成基因芯片。细菌DNA经过16S rDNA通用引物扩增后与芯片上的探针杂交，然后用荧光扫描仪检测信号。结果 基因芯片能够用于细菌检测，克服探针具有广泛和灵敏的特点，但是交叉反应明显；寡核苷酸探针具有较高的特异性，但是灵敏度稍差。结论 cDNA探针和寡核苷酸探针结合或设计几个不同的探针来指向同一株细菌很可能是将来基因芯片的检测方向。     

牛磺胆酸作用下副溶血弧菌全基因组比较转录谱的表达分析

目的 利用DNA芯片技术研究副溶血弧菌对牛磺胆酸刺激反应的全局性基因转录变化概况,找出其中的表达调控变化规律,为副溶血弧菌基因转录调控网络的构建提供实验和理论依据.方法 副溶血弧菌分别在正常和添加了50 mmol/L 牛磺胆酸的培养基中孵育至对数中期,收集菌体,提取RNA,利用全基因组DNA芯片分析比较两者基因转录变化.并应用聚类分析比较其中的变化规律.结果 比较转录谱分析证实一共有255个基因的转录表达发生显著性变化,和对照组相比,上调的基因明显占主导优势.而在这些变化的基因中,关于蛋白合成和硫代谢以及谷氨酸合成相关的基因均呈现明显的转录上调变化.结论 我们利用DNA芯片技术描绘出了副溶血弧菌在添加牛磺胆酸后全部基因转录水平变化的概图,并发现了蛋白合成,硫代谢和谷氨酸合成相关的基因的变化规律,这给我们下一步的转录调控网络研究提供了良好的靶标.     

应用O-抗原基因簇特异PCR对假结核耶尔森菌分型

目的：依据假结核耶尔森菌O-抗原基因簇多态性，应用PCR基因分型方法替代传统的血清分型方法，时本室保存的31株假结核耶尔森菌进行分型研究。方法：通过比较假结核耶尔森菌与已知血清型假结核耶尔森菌标准参考株O-抗原基因簇的差异，确定实验株的血清型。结果：应用PCR基因分型方法替代传统的血清分型方法，对本室保存的31株假结核耶尔森菌进行了成功的血清分型，血清组Ⅰ-Ⅴ与血清型0：1～0：5存在着对应关系。结论：应用PCR方法对假结核耶尔森菌进行血清分型，方法简单、迅速，同时不需要制备特异抗血清，是一种理想的血清分型替代方法。     

防污染PCR-微孔板杂交检测布鲁氏菌方法研究

目的 建立防污染PCR—微孔板杂交—EIA检测技术，并用于布鲁氏菌及其模拟感染组织中细菌的检测。方法 根据布鲁氏菌31kD热休克蛋白和外膜蛋白2B(OMP2B)基因设计引物，筛选合适引物，并建立用服嘧啶糖基化酶防污染的PCR扩增—微孔板杂交与酶联显色检测布鲁氏菌的方法，并用于模拟污染布鲁氏菌动物脏器标本的检测。结果 根据布鲁氏菌31kD热休克蛋白和外膜蛋白2B基因设计的引物，建立了复合PCR，同时检测2个基因的存在，并发现不同引物序列对PCR扩增敏感性影响较大，可以相差1000倍。用0．5U的UDG可以防止10^8产物的污染，微孔板杂交—酶联显色检测比单纯PCR—电泳敏感10倍。将该体系用于污染动物脏器的检测，可以检测出反应体系中2—200个细菌的存在。结论 研究的防污染PCR—微孔板杂交—EIA试剂克服了目前PCR试剂运输不便、产物污染所致假阳性和判定结果欠客观的缺点，为布鲁氏菌的快速检测提供了一个有力手段。